Biology

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Abstract

줄기 세포가 수있는 능력을 가진 세포로 정의 모두 자기 갱신 여러 차별 자손을 생성합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)은 초기 배아의 blastocyst에서 파생된 및 differentiative 능력 pluripotent입니다. 그들의 광대한 differentiative 가능성들을 임상적으로 유용한 세포 유형을 생성하기 위해 그들을 동축 케이블하는 방법 deducing을 중심으로 많은 연구의 초점이되었다. 마우스 ESC에서 조혈 줄기 세포 (HSC)의 성공적인 유도가 최근 완성되었으며이 비디오 프로토콜의 시각하실 수 있습니다. HSC, 거의 틀림없이 가장 임상적으로 악용 세포 인구는 조혈 malignancies 및 장애의 무수한를 치료하는 데 사용됩니다. 그러나, HSC 치료 혜택을 누릴 수 많은 환자가 적합한 기증자에 대한 액세스를 부족합니다. ESC는 이러한 환자 HSC의 대체 소스를 제공할 수. 다음 프로토콜은 ESC - HSC이 공부하고 인간 ESC에서 HSC를 격리하는 노력을 알려 될 수있는 기준을 설정합니다. 이 프로토콜에서는 ESC가 상용 혈청 사전 검사를 최적의 조혈 차별화 6 일 동안 embryoid 기관 (EBS)로 구별됩니다. EBS 다음 dissociated과 retroviral HoxB4에 감염됩니다. 마우스, 그리고 열흘 동안 크린 시토킨를 추진하고 조혈의 존재 공동 교양 - 감염된 EB - 파생 전지 OP9 기질, M - CSF - /의 calvaria에서 파생된 골수 stromal 세포 라인에 도금입니다. 이 공동의 문화 중에 감염된 세포는 세대 세포의 수백만의 100s의 이기종 수영장 결과 크게 확장합니다. 이러한 전지는 다음 구조와 reconstitute lethally 조사 마우스로 사용할 수 있습니다.

Protocol

배아 줄기 세포의 분화

ESC 트립신과 치료를 통해 배아 줄기 세포 (ESC)의 근처에 합류 플라스크를 수집합니다.
차별화 미디어 5 ML에서 세포를 Resuspend가 아닌 젤라틴 코팅 T25로 전송할 수 있습니다. 37 품어 ° C를 45 분 정도 사용합니다. 뜨는 회수하여 원심 분리를 통해 세포를 수집합니다.

참고 : ESC 문화에서 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)가 아닌 젤라틴 코팅 T25에 쉽게 부착하고 있으므로이 도금 단계에서 문화 고갈됩니다. 당신이 MEFs에 culturing 귀하의 ESC를하지 않은 경우, 당신은 사전 플레이트를 건너뛸 수 있습니다.
333,333 cells/50 ML에서 차별화 미디어에 Resuspend MEF - 고갈 ESC. 이 농도 100 ESC/15 ML 결과.
를 사용하여 다중 채널 pipettor, ^15cm이 배양 접시에 100 cells/15 ML 드롭에 플레이트 ESC. 8 채널 pipettor으로, 당신은 접시마다 방울의 18-22 행 (접시 당 5ml에 대한)에 대한 맞게 수 있어야합니다.

참고 :이 프로토콜의 경우, 방울 2-5 ^15cm이 요리 충분보다되며, 2-5 X 10 ⁶ 6 번째 EB - 파생 세포를 얻을 것입니다.
부드럽게 방울을 반전하는 접시를 플립. ° C 5 % CO ₂ 48 시간 37 알을 품다.
풀 부드럽게 15 ML 원뿔 관에 접시와 전송을 소용돌이로 방울. PBS의 4-6 ML과 접시를 씻어와 같은 15 ML 원뿔 추가할 수 있습니다.

참고 : 다섯 매달려 드롭 판까지 풀 수 있습니다. 그들이 차별을 계속하고 너무 집중되어있다면 그들은 큰 대단히 짧은 시간을 형성하는 경향으로 EBS는 자랄거야.
풀링 EBS 중력 (약 10 분)에 의해 정착하도록 허용합니다. EBS 방해없이 뜨는을 대기음. 부드럽게 10 ML 차별 미디어와 10cm 비 점착 성의 배양 플레이트에 전송에 resuspend.
37 50 RPM과 부화에 플레이트 흔드는 일에 배양 접시 ° C 5 % CO _2.
24 시간 후에 (분화의 일 사), 소용돌이 모양의 접시는 페트리 접시의 중앙에 EBS를 집중. 조심스럽게 교환 5 ML 신선한 차별화 미디어와 미디어의 50 % (5 ML). 이틀 더 배양기에 플레이트를 반환합니다.

MSCV - HoxB4 - IRES - GFP와 EB 해리와 감염

분화의 6 번째에서 15 ML 원뿔 관에 EBS를 전송할 수 있습니다. 중력에 의해 해결하도록 허용합니다.
10 ML PBS에서 미디어 및 resuspend을 대기음. EBS는 중력에 의해 다시 정착하도록 허용합니다. 대기음 PBS.
250 ML 분리 효소 믹스 1 ML PBS를 추가합니다. 가끔 효소와 EBS를 섞어 관을 소용돌이, 20 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어.
8 ML 효소 무료 분리 버퍼를 추가합니다.
EBS 완전히 dissociated 때까지 혼합물은 (; 과도한 pipetting는 EB - 유도 세포 준비 내에 사망 증가 10 번) 5 ML의 피펫을 사용하여 가루로 빻다.
1. 혼합물은 EBS가 교제를 끊다로 세포 흐리고 될 것입니다.
2. 분쇄하는 동안 원뿔 튜브의 바닥에 대한 피펫 팁을 게재하면 크게 분리를 촉진하는 전단 힘을 만들어집니다.
원심 분리를 통해 세포를 수집합니다.
Resuspend 10 % IMDM 5 ML에서 세포를 EB - 파생와 trypan 파랑 배제를 사용하여 계산

참고 : 분화의 일 넷이서 6 번째 사이에, EBS cavitate있는가, 일 6 시에, apoptosis와 세포 death.Thus 많은 양의 결과 이상 EB - 파생 세포의 30 % trypan과 청색의 착색 수 있습니다.
Resuspend EB - 파생 100,000 세포에서 세포 / 2 ML 10% IMDM + 바이러스 뜨는 같은 것을 뫄 50-10의가 8 MG / ML의 최종 농도 프로타민 황산을 achieved.Add입니다.

참고 : 판 사 6 - 잘 접시 (물론이 ML / 가정) 정도 EB / 바이러스 뜨는 믹스를 준비합니다.
플레이트 2 ML EB / 바이러스 뜨는 믹스 당 우물의 OP9 기질 세포 (아래 참조)로 사전 도금 사 육 잘 접시.
90 분간 상온에서 2,500 rpm으로 번호판을 원심 분리기. 37 인큐베이터에 번호판을 전송 ° C 5% CO _2.
4-6시간 후, 접시에서 뜨는 수확하고 원심 분리를 통해 정지에 남아있는 잠재적인 세포를 수집합니다.
48 ML 10 % IMDM에 Resuspend 펠렛 (작은 수) + 크린 시토킨. 2 ML 하는걸 / 잘 감염이 수행되었으며 뜨는 수집어진 오리지널 사 6 잘 접시에 resuspension니다.

참고 : 항상 사용 시간에 신선한 10% IMDM + 크린 시토킨를 준비합니다.
° C 5 % CO ₂ 이레 동안 37 번호판을 품어. 식민지 하루 푸르 포스트 감염 및 대형 및 7 일째에 의해 잘 형성에 의해 명확해야합니다. 강력한 확장 / 잘 일 7 40-60 식민지를 얻을 것입니다.
7 일째 이후의 감염에 트립신과 치료의 모든 우물의 모든 세포를 (OP9 기질 포함) 수집 및 수영장.

참고 : 뜨는 또는 트립신 treatment.At 이때 문화 중에 고용 PBS 세척을 삭제하지 마십시오, 일부 식민지는 느슨하게 자기편 수 많은 세포가 floa있다suspension.Collect과 수영장 모든 세척 및 뜨는에서 팅은 잠재적으로 가치있는 세포가 폐기되지 않도록합니다.
8 ML 신선한 10 % IMDM에 Resuspend 세포 + 크린 시토킨. 네 T75 flasks 2 개의 MLS / 플라스크를 배포합니다. 각 플라스크에 추가 13 MLS 10 % IMDM의 이상 크린 시토킨를 추가합니다. 37 품어 ° C 5% 사흘 동안 CO ₂ (10 일 게시물 감염 총).

문화 OP9 기질의 도금

20% - 멤의 표준 프로토콜에 따라 OP9 기질을 유지합니다. confluency로 성장하면 OP9 전지는 속성을 변경합니다. 항상 더 이상 1시 3분 이상의 분할에 confluency 80 % 분할.
24 이전에 / 잘 20% - 멤 네 개의 6 - 잘 접시의 MSCV - HoxB4 - IRES - GFP, 플레이트 25,000 OP9 세포와 6 번째 EB - 파생 세포의 감염 시간.

수집, 분류 및 이식

트립신과 치료를 통해 열흘 동안 OP9 기질에 대한 확장된 세포를 수집합니다. 세포를 세어보세요.

참고 : 뜨는 또는 PBS를 폐기하지은 트립신 처리하는 동안 고용 씻는다. 문화의이 시점에서, 일부 식민지는 느슨하게 자기편 수 있으며 suspension.Collect과 수영장에 잠재적으로 가치있는 세포가 폐기되지 않도록 모든 세척 및 뜨는을 부동 많은 세포가있다.

참고 : 좋은 확장 160-200 X 10 ⁶ 세포의 총, 40-50 X 10 ⁶ 세포 / 감염 원래 6 자 플레이트 사이에 양보해야합니다.
세포는 프로토콜이 시점에서 표준 기술에 따라 자기 구슬 선택이나 외과 통해 fractionated 수 있습니다.
이식의 경우, 방사선 조사 2.5 시간의 9.25 GY의 분할 선량의 대상이 Rag-2/gc 결함 수신자 (15~22g 사이 무게)로 역전사 궤도 또는 꼬리 정맥 주입을 통해 세포를 제공합니다. 분리.

참고 : 동물의 무게는 방사선 조사의 시간에 15~22그램 사이에 떨어질 것이 중요 좋습니다. 그들이 22g보다 큰 경우, 9.25 GY 해당 절제를 보장하고 세포가 치명적인 조사 및 / 또는 합치다 조혈 구획의 구조를 중재하지 않을 수 있습니다 방사선의 충분한 복용량되지 않습니다. 큰 동물을 이식하는 경우, 적절한 방사선 선량은 실험적으로 결정되어야합니다.
2-5 X 10 ⁶ 세포 / 동물의 최소 복용은 치명적인 조사에서 구출을 보장하기 위해 필요합니다. 세포를 fractionating 경우, 2-5 X 10 ⁶ 세포에 해당하는 금액 (예 : 관심의 인구가 세포의 unfractionated 수영장의 10 %를 대표하는 경우, 2-5 X 10 ⁵ 세포 / 동물을 주사) 주사.

참고 :> 2 주입하면 X 10 ⁶ 세포는 항상 세포의 높은 번호가 복고풍 - orbitally 전송하는 경우 발생할 수 있습니다 궤도에서 기형 종의 형성을 피하기 위해 꼬리 정맥을 통해 주입.
유지 래그 - 2 ^{- / -} / GC ^{- / -} autoclaved 새장에 부족한받는 사람. 동물 시설의 "청결"에 따라 사후 이식 동물 치명적인 방사선 다음 5 주 동안 산성의 물 또는 Trimethiprim - Sulfasoxazole (Septra)의 관리를 요구할 수 있습니다.
삼주 후 이식에서 말초혈에서> 90 % GFP + ES - 파생 leukocytes 것으로 기대하고 있습니다. lymphocytes이 retroviral HoxB4 - IRES - GFP를 침묵하는 것으로 알려져 있지만 Engraftment는 멀티 혈통해야합니다.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc