Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Summary

A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare

Abstract

Sequenziamento RNA che la co-immunoprecipitato (co-IP) con le proteine ​​RNA binding ha aumentato la nostra comprensione di splicing, dimostrando che ubicazione vincolante spesso influenza la funzione di un fattore di splicing. Tuttavia, come con qualsiasi strategia di campionamento la possibilità di individuare un RNA legato a un fattore di splicing è proporzionale alla sua abbondanza cellulare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio in vitro per la rilevazione sulle specificità di legame altrimenti transitorio pre-mRNA. Questo approccio utilizza una piscina appositamente progettato oligonucleotide che le piastrelle in introni, esoni, giunzioni di splicing, o altre pre-mRNA. La piscina è sottoposto a una sorta di selezione molecolare. Qui, noi dimostrare il metodo separando la oligonucleotidi in una frazione legati e non legati e utilizzare una strategia a due serie a colori per registrare l'arricchimento di ogni oligonucleotide nella frazione legata. I dati di matrice genera mappe ad alta risoluzione con la capacità di identificare la sequenza-specifica e strutturale determina di ribonucleoproteina (RNP) vincolanti per pre-mRNA. Un vantaggio unico di questo metodo è la sua capacità di evitare il bias di campionamento verso mRNA associati con IP corrente e le tecniche di SELEX, come la piscina è appositamente progettata e sintetizzata dal pre-mRNA sequenza. La flessibilità della piscina oligonucleotide è un altro vantaggio in quanto lo sperimentatore sceglie quali le regioni di studiare e piastrelle in tutto, adattando la piscina alle loro esigenze individuali. Utilizzando questa tecnica, si può dosaggio gli effetti di polimorfismi o mutazioni su vincolante su larga scala o clonare la libreria in un reporter splicing funzionale e identificare oligonucleotidi che si arricchisce nella frazione incluso. Questo romanzo in vitro ad alta risoluzione schema di mappatura fornisce un modo unico per studiare le interazioni RNP con transitorio pre-mRNA specie, la cui bassa abbondanza li rende difficili da studiare con le attuali tecniche in vivo.

Protocol

Piscina progettazione e oligo recupero

1. Il primo passo è quello di progettare il pre-mRNA piscina da studiare. Questo può essere fatto utilizzando il browser UCSC Genome e il download di particolari geni, giunzioni di splicing, o altre aree di interesse.
2. Una volta che le finestre di interesse sono stati selezionati, attraverso le piastrelle computazionalmente con le seguenti: lunghezza leggere dovrebbe essere di 30 nucleotidi con un 10 sovrapposizione nucleotide, quindi ogni oligo è spostato dal 20 nucleotidi prima uno. * Sovrapposizione Oligo deve essere aumentata in prossimità di siti di splicing per assicurare un'adeguata copertura, aumentando la sovrapposizione 10-20 nucleotidi può realizzare questo.
3. Fianco ogni 30 oligo-nucleotidi con sequenze primer universale, che verrà utilizzato per amplificare la valle piscina. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione.
4. Per recuperare il DNA oligo dalla superficie del microarray di iniziare a collocarlo nella diapositiva copertura matrice in una camera di ibridazione di array e delicatamente pipettaggio 500 ml di dH ₂ O sul vetrino
5. Panino della matrice su parte superiore della diapositiva copertura, avendo cura di evitare bolle d'aria che possono interferire con il processo. Assicurarsi di posizionare il volto serie giù in modo che il lato con l'oligo sta toccando la superficie dell'acqua. Una buona regola è "Agilent tocca Agilent", che significa che l'etichetta Agilent sulla matrice si affaccia l'etichetta Agilent sul vetrino di copertura
6. Chiudere la camera di ibridazione e ruotare la notte a 99 ° C in un fornetto
7. Il giorno seguente, rimuovere con attenzione l'array dalla camera e di erogare l'acqua, che ora contiene le oligo liberato dalla superficie dell'array. Questa è la piscina oligo
8. Posizionare la piscina in una provetta 1,5 ml Eppendorf e sonicare la piscina al 50% di ampiezza per 3-5 impulsi secondo
9. Successivamente, amplificare la vasca di ciclo PCR bassa, utilizzando il primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine. Per il primo turno, denaturare a 94 ° C per 1 minuto, annealing a 55 ° C per 20 secondi, e allungare per 1 minuto a 72 ° C. Per i turni successivi, fare 10 secondi, 20 secondi e 10 secondi a ciascuna temperatura rispettivamente, con un passo allungamento finale di 5 minuti a 72 ° C. Poiché il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l'efficienza di recupero oligo, può essere necessario per cercare i numeri ciclo multipli. Fare attenzione a non a un eccesso di amplificare la piscina, che è significata da una banda spalmato su un gel di acrilammide. Campioni di PCR amplificato può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell'uso.
10. La fase finale in preparazione oligo è quello di trascrivere l'RNA utilizzando il kit MEGAshortscript ™ da Ambion. * Il seguente protocollo è stato adattato da Ambion
    1. Scongelare il tampone di reazione 10x T7, quattro soluzioni ribonucleotide e acqua a temperatura ambiente, mantenendo la miscela enzimatica T7 su ghiaccio
    2. Montare la miscela di reazione in un RNasi-free provetta a temperatura ambiente. Componenti del tampone di reazione può causare DNA stampo per precipitare se la reazione è mista su ghiaccio.
    3. Nel seguente ordine, pipetta 3 ml acqua priva di nucleasi, 2 l di buffer di reazione 10x, 2 ml di soluzione ogni 75 mm NTP, 5 ml di DNA stampo (la piscina oligo amplificato PCR) e 2 ml di T7 enzima, per un volume finale di 20 l
    4. Flick il tubo delicatamente per mescolare la reazione poi brevemente microcentrifuga per raccogliere il composto sul fondo della provetta.
    5. Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 2 ore. Tempo di incubazione sarà modello-dipendente, per cui può essere necessario utilizzare un time-corso esperimento per determinare il tempo ottimale di incubazione per la resa massima
    6. Dopo 2 ore, rimuovere il DNA stampo con l'aggiunta di 1 ml di DNasi Turbo alla reazione e incubare a 37 ° C per altri 15 minuti
    7. Terminare la reazione e recuperare l'RNA per estrazione fenolo / cloroformio e precipitazione in etanolo.
       1. Per un volume di reazione di 20 microlitri, aggiungere 115 ml di dH ₂ O e 15 ml di acetato di sodio 3 M per la reazione.
       2. Mescolare accuratamente, quindi aggiungere 75 ml di acido fenolo e 75 microlitri di cloroformio. Mescolare la soluzione con il vortex, poi microcentrifuga per un minuto a 13.000 giri al minuto a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e ripetere l'estrazione
       3. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 150 ml di cloroformio. Vortex il composto e centrifuga come prima. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta.
    8. Recuperare l'RNA con l'aggiunta di due volumi del 100% di etanolo freddo per lo strato acquoso e mescolando bene. Freddo la miscela per un minimo di 15 minuti a -20 ° C quindi si centrifuga a 4 ° C per 15 minuti alla massima velocità per far sedimentare l'RNA. Rimuovere con cura il supernatante e risospendere il pellet in 105 ml di 0.1x Tris-EDTA (TE) Buffer ..
11. E 'difficile rimuovere tutti i nucleotidi liberi dalla reazione Kit T7, quindi per i risultati più accurati, quantificare l'RNA utilizzando RiboGreen.
    1. Per iniziare la quantificazione, in primo luogo diluire abbastanza 1x TE, 2.300 microlitri + 50μL/sample.
    2. Quindi, rendere il RiboGreen. Avrete bisogno di 1000 ml + 50 microlitri / campione. Per i campioni di alta gamma (1 mg / ml a 20 ng / ml) mescolare il 1:200 RiboGreen in 1x TE, per i campioni di gamma bassa (50 ng / mL a 1 ng / ml) mescolare il 1:2000 RiboGreen in 1x TE ; Pipettare 50 ml di soluzione RiboGreen in ciascun pozzetto di una piastra opaca, a partire da A1 e in movimento verso il basso, e non tra
    3. Diluire una soluzione madre di RNA a 2 mg / ml per i campioni di alta gamma o 100 ng / mL per i campioni gamma bassa
    4. Utilizzando le soluzioni stock, creare una curva standard da sei successive diluizioni 1:02 dell'originale 2 mg / ml o 100 ng / mL magazzino; Pipettare 240 l di stock in un tubo striscia di PCR. Nei restanti 7 tubi, pipetta 120 ml di TE 1x. Prendete 120 microlitri dal ceppo RNA bene, e mescolare con tubo 2. Prendete 120 microlitri da provetta 2 e miscelare con tubo 3. Ripetere l'operazione fino tubo 7. Tubo 8 avrà solo TE e sarà il vostro vuoto. Pipettare 50 ml di soluzioni curva standard nella piastra opaca, A1: H2 (eseguire la curva due volte)
    5. In un nuovo tubo, mescolare 45 ml di TE con 5 ml di piscina oligo e aggiungere tutti i 50 microlitri di un pozzo che contiene 50 ml di RiboGreen.
    6. Utilizzando un lettore di piastre impostare la macchina per leggere la fluorescenza dall'alto dopo un minuto di mescolare con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e lunghezza d'onda di emissione di 530 nm e leggere la piastra
    7. Utilizzare la curva standard generato per quantificare l'RNA recuperato, che devono essere conservati a -20 ° C.

Co-immunoprecipitazione della piscina oligo con un RNP di interesse

1. Prima di iniziare la co-immunoprecipitazione, preparare la proteina A e proteina G Dynabeads da Invitrogen mescolando in un rapporto di 1:1 fino ad un volume finale di 50 microlitri per reazione. Ad esempio, per due reazioni si dovrebbe aggiungere 50 microlitri di ciascun ciascuna sfera.
2. Utilizzare un supporto magnetico di separazione come questo da Novagen per tenere le sfere in posizione mentre si rimuove il supernatante e lavare le perle due volte con un uguale volume di freddo 1x PBS
3. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le sfere in un volume uguale di freddo 1x PBS e aggiungere 2 ng degli anticorpi per reazione. Tale importo può variare a seconda dell'anticorpo, così la sperimentazione è necessario trovare le condizioni ottimali.
4. Incubare l'anticorpo / tallone miscela notte a 4 ° C su una piattaforma rotante
5. Al mattino, aggiungere 2 mg per reazione di RNA totale sonicato lievito per bloccare legame non specifico, e ruotare per altri 30 minuti a 4 ° C.
6. Utilizzando il sostegno magnetico per tenere le perline, rimuovere il supernatante e lavare le perle due volte con PBS freddo 1x, lasciando la PBS dal secondo lavaggio nel tubo.
7. Estrarre nuovi tubi, uno per ogni reazione e aliquota 50 microlitri della miscela tallone in ciascuna provetta. Lasciate le perline sedersi mentre si prepara una master mix
8. Per ogni reazione di aggiungere 200 ng del pool di oligo, un rapporto equimolare di primer di protezione, 2 mg di RNA totale sonicato lievito, 20 ml di estratto di HeLa nucleare (questa è la fonte RNP), ed E tampone per portare il volume fino a 120 microlitri. Il primer di protezione sono le versioni di RNA del primer universale. Modelli ordine trascrizione del primer universale con un tag T7 aggiunto alla fine, poi trascrivere RNA da i modelli utilizzando il kit MEGAshortscript ™.
9. Eliminare il surnatante dal aliquote tallone e perline risospendere in 120 microlitri della master mix. Rock the reazioni a 4 ° C per 1-2 ore.
10. Dopo l'incubazione, per ogni reazione, rimuovere una piccola aliquota (tra cui le perle) per un campione "totale" RNA
11. Mettere il resto delle reazioni sulla separazione magnetica riposare e rimuovere il surnatante. Anche se non è necessario analizzare questo flow-through a valle del campione, può essere utile per salvare.
12. Lavare le perle 1-2 volte con 50 ml di freddo 1x PBS. L'RNA legato l'anticorpo sulle perle è il campione "IP".
13. Risospendere il "totale" e la "IP" perle in 50 ml di 1% SDS a tampone 0,1 x TE e riscaldare i campioni a 65 ° C per 15 minuti per eluire l'RNA.
14. Rimuovere il surnatante, che ora contiene l'RNA che è stato precedentemente legato ai talloni e pulire per estrazione fenolo / cloroformio seguita da una precipitazione in etanolo. Asciugare il pellet e risospendere in 50 microlitri di buffer TE 0.1x.

Trascrizione inversa e l'amplificazione di co-IP campioni in preparazione per l'etichettatura aminoallyl

1. Successivamente, i campioni di RNA deve essere trascrizione inversa e PCR amplificato. Per la reazione di trascrizione inversa, utilizzare il primer reverse universale.
2. Per ogni campione, inizia mescolando 1 ml diil primer reverse universale, con 1 ml di modello di RNA (dalla reazione immunoprecipitazione) e 10 ml di dH ₂ O. Calore le reazioni a 70 ° C per 5 minuti poi raffreddare sul ghiaccio o mantenere a 4 ° C.
3. Mentre i campioni raffreddare, portare il mix successivo master. Per ogni reazione di combinare 4 ml di 10 mM dNTPs, 2 ml di tampone 10x Arrayscript, 1 inibitore microlitri RNasi, enzimi e 1 microlitri trascrizione inversa. Mescolare bene e aggiungere 8 ml di mix master per ogni reazione di trascrizione inversa.
4. Utilizzare una macchina di PCR per incubare i campioni a 42 ° C per 2 ore, seguita da 95 ° C per 5 minuti, poi 4 ° C fino a quando i campioni sono necessari per l'amplificazione.
5. Dopo la trascrizione inversa campioni di RNA, PCR li amplificano utilizzando il primer universale, con uno dei primer contenente un tag T7. Il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipende l'efficienza del co-IP quindi potrebbe essere necessario provare più cicli. Ogni reazione richiede 5 ml di tampone di reazione 10X Taq, 0,2 ml di ogni primer (100 mm), 1 l di modello di cDNA (dalla reazione di trascrizione inversa), 1 ml di 10 mM dNTPs, 42,2 ml di dH ₂ O, e 0,4 l di enzima Taq.
   
   Iniziare la PCR incubando i campioni a 94 ° C per 3 minuti. Successivamente, per ogni ciclo di snaturare, a 94 ° C per 45 secondi, annealing a 55 ° C per 30 secondi, e allungare a 72 ° C per un minuto, con un allungamento finale a 72 ° C per 10 minuti.
6. Successivamente, trascrivere i campioni di nuovo utilizzando il kit MEGAshortscript ™, però, questa volta aggiungere 2 l di aminoallyl UTP, al posto del UTP T7. L'UTP aminoallyl saranno utilizzati per etichettare l'RNA con i coloranti Cy.
7. Fenolo / cloroformio ed etanolo precipitare i campioni. NON utilizzare Glycoblue o acetato di ammonio, entrambi i quali possono interferire con l'ibridazione dei campioni alla matrice. Asciugare il pellet e risospendere in 4,5 l di carbonato di sodio 0,1 M.

Amino-allil etichettatura di RNA con coloranti Cy

1. Per iniziare il protocollo di etichettatura sciogliere ciascuna delle tinture fluorescenti, Cy3 e Cy5, in 45 ml di DMSO. Per evitare la luce, avvolgere i tubi in foglio di alluminio e conservare a -20 ° C al buio
2. Aggiungere 2,5 l di acqua priva di nucleasi a RNA campioni e mescolare accuratamente
3. Successivamente, aggiungere 3 ml di Cy3 al campione "totale", e 3 ml di Cy5 al campione "IP". Incubare i campioni al buio per 1 ora a temperatura ambiente; Il Cy-3 del campione diventa rosso o rosa, mentre il Cy-5 diventerà blu.
4. Per terminare la reazione, aggiungere 6 uL di 4 M idrossilammina-HCl per ogni campione, mescolare bene e far girare brevemente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Purificare i campioni etichettati per estrazione fenolo / cloroformio seguita da etanolo precipitazioni e risospendere pellet in 50 ml di 0,1 x TE

Ibridare i campioni del microarray utilizzando il kit Array Agilent ibridazione

1. Iniziare l'ibridazione con delicatezza mescolando 50 ml di tampone di bloccaggio 10x, 140 ml di nucleasi-free H2 _O, 25 microlitri della Cy3 marcato piscina "totale", 25 microlitri della piscina-Cy5 etichettato "IP", 10 microlitri della frammentazione tampone 25x e 250 ml di buffer di ibridazione 2x, avendo cura di evitare l'introduzione di bolle. Microcentrifuga il campione leggermente per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo e anche per ridurre le bolle.
2. Posizionare l'O-ring far scivolare il coperchio della camera di ibridazione e con attenzione pipetta la soluzione sul vetrino.
3. Posizionare la matrice di rilevamento sulla parte superiore della diapositiva copertura a "sandwich" la soluzione. Ricordate di orientare la diapositiva array in modo che l'etichetta Agilent sulla matrice volti l'etichetta Agilent sul vetrino di copertura.
4. Morsetto della diapositiva / array panino nella camera di ibridazione e ruotare a 50 ° C per 3 ore.
5. Mentre la serie è rotante, effettuare le seguenti soluzioni di 50 mL in provette coniche da 50 ml: una conica riempita con 50 ml di dH ₂ O, due 1x SCC soluzioni tampone, ciascuno in un tubo separato, e un buffer di 2x SCC.
6. Dopo le tre ore di incubazione, con attenzione sbloccaggio l'array / slide panino e mettetelo nel 50 ml conica contenente il tampone 2x SCC. Utilizzando un paio di pinzette, separare delicatamente l'array dalla diapositiva copertura ed estrarre il vetrino di copertura. Fare attenzione a non toccare l'array come la diapositiva è tirato fuori. Chiudere il conica e capovolgere delicatamente per 60 secondi.
7. Con le pinze, la matrice di trasferimento alla soluzione 1x SCC, tappare la provetta, e capovolgere delicatamente per 1 minuto poi trasferire l'array per la seconda soluzione 1x SCC e ancora capovolgere delicatamente per un altro minuto.
8. Infine, la matrice di trasferimento al tubo di dH ₂ O e capovolgere delicatamente per 30 secondi.
9. Secco l'array ponendo il bordo del vetrino su un Kimwipe. Continuare a ruotare l'array sul pulire facendo attenzione a non disturbare il lato contenente le oligo.
10. Posizionare l'array a secco inuna vuota da 50 ml tubo conico e scansione con uno scanner Microarray

Interpretazione dei Microarray

1. Lo scanner microarray creerà una immagine TIF dell'array. Eseguire questa immagine attraverso il software di Agilent Feature Extraction, utilizzando il file della griglia (fornito da Agilent) che è unico alla tua riserva specifica.
2. Il software Agilent interpreterà il segnale in ogni funzione per creare un file, che viene analizzato con uno script Perl. Il segnale ad ogni funzione è di normalizzare l'intensità totale in quel canale. Per esempio a una caratteristica particolare nel canale verde, l'intensità del canale verde per la funzione individuale è divisa per l'intensità totale del canale verde su tutte le caratteristiche. Il risultato finale è il rapporto log del canale rosso sul canale verde a ciascuna funzione sulla matrice.
3. I dati piscina oligo dal microarray può essere ri-mappata nuovo al genoma per ottenere un quadro di dove e come fortemente, la RNP di interesse legato.

Figura 1. Schema sperimentale

A. Piastrelle schema. Dopo aver selezionato e il download di pre-mRNA sequenze di interesse, l'area scelta è piastrellato con finestre in 30 nucleotidi che cambiano con incrementi di 10 nucleotidi. Universale fianco primer siti ogni lato della finestra.

B. Sintesi di array. Piastrelle ordini oligo devono essere presentate alla Agilent, dove le sequenze verrà stampato su un oligonucleotide microarray su ordinazione.

C. Co-immunoprecipitazione. Dopo aver fatto bollire l'oligo fuori dell'array, incubare in estratto HeLa nucleare, quindi aggiungere l'estratto di sfere magnetiche che vengono preparati con un anticorpo contro la RNP di interesse. Etichetta la piscina oligo partire Cy3 e la piscina legato IP con Cy5 e applicare alla matrice di rilevamento e scansione.

Figura 2. L'annotazione del genoma e con l'analisi dei dati di arricchimento.

A. Convertire il punteggio medio di ogni coordinata dai dati genomici array di base-ten log e mappa che punteggio alle coordinate date. Un esempio di questo passo media viene somministrato per 3 sovrapposizione di 30 nt oligo con i punteggi di 2, 4 e 0,5, in cui viene rappresentata graficamente il punteggio di arricchimento medio per ogni 10-nt finestra sopra. Le regioni genomiche selezionato può essere visualizzato usando una traccia personalizzati nel Browser Genome USCS. La finestra del browser esempio dato è nel gene clta, dove sono riportate le caratteristiche gene (esoni / introni / splicing alternativo, ecc) lungo la parte inferiore e punteggi arricchimento log media dal PTB-bound oligo sono rappresentate da barre rosse verticali scure. PTB si lega fortemente a monte dell'esone 2 nel tratto polypyrimidine.

Discussion

Quando si esegue questa procedura il suo importante ricordare che la creazione della piscina è flessibile e aperto a modifiche sia a livello del RNA o proteine. A livello di RNA regioni ortologhi, le mutazioni malattia, polimorfismi o mutazioni casuali possono essere introdotti nella sequenza di oligonucleotidi. A livello della proteina del fattore di RNA binding può essere modificata o modifiche fosforilazione altro post traduzionali. Inoltre, l'ambiente vincolante possono essere manipolati per aumentare o diminuire i livelli di ulteriori fattori che interagiscono e competono con le proteine ​​RNA binding di interesse.