Summary
प्रोटीन पारगमन कोशिकाओं में biologically सक्रिय प्रोटीन के प्रत्यक्ष वितरण के लिए सक्षम बनाता है. डीएनए अभिकर्मक या वायरल पारगमन जैसे पारंपरिक तरीकों के विपरीत इस गैर इनवेसिव प्रतिमान एक titratable सेलुलर विषाक्तता और स्थायी आनुवंशिक संशोधन के द्वारा oncogenic परिवर्तन के जोखिम circumventing तरीके में अत्यधिक कुशल सेलुलर हेरफेर की अनुमति देता है.
Abstract
प्रोटीन पारगमन तकनीक स्तनधारी कोशिकाओं में biologically सक्रिय सामग्री के प्रत्यक्ष वितरण सक्षम बनाता [समीक्षा के लिए 1,2 देख]. के लिए यह एक तथाकथित सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (सीपीपी) के translocating क्षमता का उपयोग कर सकते हैं, यह भी प्रोटीन पारगमन डोमेन (PTDs) के रूप में नामित है. मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) जैसे प्रोटीन (प्रतिलेखन के ट्रांस - उत्प्रेरक) व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है से व्युत्पन्न जैसे सीपीपी. जैसे सकारात्मक आरोप लगाया सेल पारगम्यता जिससे endocytosis या / और प्रत्यक्ष झिल्ली 2 पैठ द्वारा सेलुलर झिल्ली की बाधाओं पर काबू पाने को बढ़ावा देता है. परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ संयोजन में (NLS) संलयन प्रोटीन के नाभिक प्रदर्शन कार्यक्षमता में प्रवेश कर रहे हैं. हमारे वीडियो प्रस्तुति सेल पारगम्य प्रोटीन इंजीनियरिंग, निर्माण, उत्पादन और डीएनए संशोधित एंजाइम Cre के एक सेल पारगम्य संस्करण के आवेदन के लिए एक दृष्टांत के रूप में दर्शाता है.
Cre साइट विशिष्ट है कि recombinase को पहचाना और इन विट्रो में और vivo में 34 आधार जोड़ी loxP साइटों recombine स्तनधारी कोशिकाओं में करने में सक्षम है है. इसलिए Cre / loxP प्रणाली को व्यापक रूप से सशर्त रहने वाले 3,4 कोशिकाओं के जीनोम में परिवर्तन पैदा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कोशिकाओं को सक्रिय Cre recombinase के वितरण, तथापि, एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है.
हम pSESAME सदिश प्रणाली है, जो जीन के हित के एक सीधा सम्मिलन की अनुमति देता है और एक मंच प्रदान करने के लिए तेजी से अलग डोमेन और एक सुविधाजनक और मानकीकृत तरीके में वेक्टर के भीतर का उपयोग किया टैग क्लोन का वर्णन. अलग टैग के उलटफेर संलयन करने के लिए एक उच्च उपज और बेहतर विलेयता हासिल संभावना प्रदान प्रोटीन की जैव रासायनिक गुणों को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है. हम प्रदर्शन कैसे व्यक्त करने के लिए और में और ई. कोलाई से पुनः संयोजक सेल permeant प्रोटीन शुद्ध. पुनः संयोजक Cre प्रोटीन की कार्यक्षमता के अंत में अपनी intracellular recombinase गतिविधि का आकलन करके सेल संस्कृति में मान्य है.
Protocol
अभिव्यक्ति वेक्टर और अभिव्यक्ति का निर्माण:
अभिव्यक्ति pSESAME Cre वेक्टर AvrII और NheI प्रतिबंध मानक क्लोनिंग तरीकों का उपयोग साइटों के माध्यम से एक Cre एन्कोडिंग pSESAME में टुकड़ा डालने द्वारा निर्मित किया गया था. pSESAME एक संलयन हिस्टडीन-टैग, जैसे डोमेन, एनएलएस अनुक्रम और Cre, संक्षिप्त HTNCre से मिलकर प्रोटीन encodes. HTNCre की अभिव्यक्ति के लिए pSESAME Cre TUNER pLacI (DE3) में तब्दील किया गया था और एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया.
- एक संस्कृति पर रात एक pipet ग्लिसरॉल स्टॉक से बदल बैक्टीरिया के साथ लेपित टिप का उपयोग कर inoculated था. अधिक रात की संस्कृति लेग 0.5% ग्लूकोज के साथ पूरक मीडिया के शामिल [v / v] और carbenicillin 50 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में था और 37 से बढ़ने की अनुमति दी ° सी 16 घंटे के लिए.
- अगले दिन घनी वृद्धि हुई खत्म रात की संस्कृति के लिए 1 से 40 के अनुपात में अभिव्यक्ति संस्कृति टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में डाल दिया था अभिव्यक्ति संस्कृति टीबी 100 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में 0.5% ग्लूकोज [v / v] और एम्पीसिलीन के साथ पूरक मीडिया के शामिल है.
- 1.5 की एक 595 आयुध डिपो पर अभिव्यक्ति संस्कृति एक एच. के लिए 0.5 मिमी IPTG के साथ प्रेरित किया गया था
- इसके बाद बैक्टीरिया SLA3000 रोटर में 10 मिनट के लिए 5000 rpm पर centrifugation द्वारा एकत्र किए गए थे.
- जीवाणु छर्रों शून्य से 20 डिग्री शुद्धि सी जब तक संग्रहीत किया गया.
सेल पारगम्य प्रोटीन शुद्धीकरण:
- जमे हुए बैक्टीरिया छर्रों कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10 एमएल प्रति लीटर फ्लास्क संस्कृति lysis बफर में resuspended थे.
- सस्पेंशन तो अतिरिक्त 15 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल lysozyme के साथ incubated था जबकि कमरे के तापमान पर मिश्रण.
- 25 यू / एमएल benzonase बाद में जोड़ा गया है और incubated जबकि कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण.
- बर्फ पर सत्ता के 45% पर 1.5 0.5 दालों के साथ मिनट के लिए sonification के बाद एक एमएल ठंड tartaric नमक बफर (TSB) एमएल प्रति निलंबन सावधानी जबकि जोड़ा गया 5 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण और incubated. Lysate अंश (एल) के एसडीएस पृष्ठ नमूना लिया गया था.
- साफ़ lysate centrifugation द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए 30,000 पर जी पर प्राप्त हुई थी (एस) घुलनशील और अघुलनशील भिन्न (आई) के एसडीएस PAGE नमूने ले जाया गया.
- सतह पर तैरनेवाला ताजा 50 एमएल बाज़ ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया था और फिर धीरे से 4 में 1 घंटे के लिए मिश्रित डिग्री सेल्सियस 50% नी - NTA प्रारंभिक अभिव्यक्ति संस्कृति के प्रति लीटर घोल के 2 एमएल के साथ.
- निलंबन एक गुरुत्व प्रवाह EconoPac स्तंभ (अंश प्रवाह के माध्यम से लिया गया था (एफटी) एसडीएस पृष्ठ नमूना) में पैक किया गया था और 5 धोने बफर के बिस्तर के संस्करणों के साथ दो बार धोया. दोनों धोने भिन्न (W1 और W2) के एसडीएस PAGE नमूने एकत्र किए गए थे.
- HTNCre युक्त भिन्न 3 elution बफर और eluate अंश (ई) के एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए नमूना के बिस्तर संस्करणों के साथ eluted थे लिया गया था.
- Imidazole elution अंश उच्च नमक बफर के खिलाफ दो बार dialyzing द्वारा हटा दिया गया था.
- प्रोटीन समाधान आगे ग्लिसरॉल बफर के खिलाफ दो बार dialyzing से ध्यान केंद्रित किया गया था. डायलिसिस के सभी चरणों में बफर के नमूने के अनुपात कम से कम 50 थी. यह प्रक्रिया एक ग्लिसरॉल स्टॉक 200 और 450 सुक्ष्ममापी के बीच एक सामान्य एकाग्रता में HTNCre युक्त समाधान के परिणामस्वरूप, अभिव्यक्ति संस्कृति का 1 लीटर यानी ~ प्रोटीन की 12 मिलीग्राम में परिणाम होगा. ग्लिसरॉल शेयर (जी एस) के एसडीएस PAGE विश्लेषण के लिए नमूना एकत्र किया गया था. HTNCre शेयर समाधान 20 ऋण पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
चित्रा 1: Cre recombinase के शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान एकत्र नमूनों का विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ . Cre अभिव्यक्ति की प्रेरण lysate अंश में प्रमुख बैंड द्वारा संकेत दिया है. हालांकि प्रोटीन का एक हिस्सा अघुलनशील है Cre प्रोटीन आगे eluate और ग्लिसरॉल शेयर भिन्न में देखा के रूप में समृद्ध कर सकते हैं. एल: lysate, मैं: अघुलनशील एस: सतह पर तैरनेवाला, एफटी: प्रवाह के माध्यम से, डब्ल्यू: धुलाई, ई: Eluate, जी एस: Gylcerol स्टॉक. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
Murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) में प्रोटीन पारगमन:
- एक सशर्त संवाददाता β Galactosidase 5 का निर्माण ले ES कोशिकाओं एकल पक्षपाती कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए TrypLE ™ एक्सप्रेस का उपयोग कोशिकाओं के रूप में वरीयता प्राप्त थे. 4 से 6 घंटे के बाद कोशिकाओं को फिर से संलग्न था और मध्यम हटा दिया गया था.
- इसके बाद ES कोशिकाओं HTNCre युक्त 16 घंटे के लिए मध्यम के साथ incubated रहे थे.
- HTNCre प्रोटीन का एक उचित मात्रा में (10 सुक्ष्ममापी के इसी) ग्लिसरॉल स्टॉक से बाहर ES मध्यम और बाद में बाँझ filtrated (0.22 सुक्ष्ममापी) में पतला था.
- प्रोटीन पारगमन मध्यम के बाद वापस सामान्य मध्यम विकास के लिए बदल गया था.
- के बाद दो दिनों कोशिकाओं पीबीएस से धोया गया और 10 मिनट के लिए 4% (पीएफए) Paraformaldehyde साथ तय.
- दो addiपीबीएस के साथ राष्ट्रीय धोने कदम से पहले एक्स - लड़की धुंधला प्रदर्शन किया गया था मार डाला गया.
- फिक्स्ड कोशिकाओं एक्स - लड़की धुंधला 6 समाधान की एक परत के साथ कवर किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म incubated
प्रतिनिधि परिणाम:
अगले दिन एक्स - लड़की धुंधला समाधान आकांक्षी था और कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए पीबीएस की एक परत के साथ कवर किया गया. Recombined कोशिकाओं के 80 से 100% murine ES β-Galactosidase गतिविधि द्वारा न्याय कोशिकाओं के भीतर देखा जा सकता है है.
Discussion
Cre संलयन प्रोटीन की शुद्धि की प्रक्रिया के दौरान यह महत्वपूर्ण है के लिए बर्फ के ठंडे टीबीएस बफर के अलावा centrifugation से पहले नहीं चूकना. अन्यथा Cre recombinase ग्लिसरॉल बफर के भीतर वेग आदत है.
यदि eluate अंश बन करने के लिए प्रकट होता है संलयन प्रोटीन अतिरिक्त elution बफर के उच्च एकाग्रता के कारण turbid समाधान जब तक फिर से मंजूरी दे दी है जोड़ा जाना चाहिए.
Cre संलयन प्रोटीन के 10 सुक्ष्ममापी के आवेदन आमतौर पर 80 से 100% की एक पुनर्संयोजन दक्षता में परिणाम है. भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) ES सेल मध्यम के एक प्रमुख घटक होने के जोरदार प्रोटीन पारगमन रोकता. इसलिए Cre recombinase के उच्च एकाग्रता के लिए इस्तेमाल किया जा था. जब सीरम मुक्त परिस्थितियों में काम कर रहे कम प्रोटीन (0.5 - 2 सुक्ष्ममापी) के लिए इसी तरह की पुनर्संयोजन क्षमता को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हाथ में pSESAME वेक्टर प्रणाली के साथ एक Oct4 और Sox2 7 और 8 Scl/Tal1 जैसे प्रतिलेखन कारकों सहित अन्य प्रोटीन प्रोटीन पारगमन की तकनीक लागू कर सकते हैं.
Acknowledgments
हम ओलिवर Brüstle और स्टेम सेल इंजीनियरिंग समूह, बॉन विश्वविद्यालय समर्थन और बहुमूल्य विचार - विमर्श के लिए, के सभी सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. हम एसडीएस पृष्ठ और परियोजना भर में स्थायी समर्थन की तैयारी के लिए Sabine स्चेंक धन्यवाद. निकोल Russ और अन्ना Magerhans उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है. इसके अलावा, हम फिल्म के उत्पादन के लिए Andreas बार और शीला Mertens धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम वोक्सवैगन फाउंडेशन (I/77864 AZ) और शिक्षा और अनुसंधान (BMBF, 01 GN 0,813) जर्मन मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen, EMD Millipore | 70625 | |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 3783.2 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth Gmbh | T876.1 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| HCl | Carl Roth Gmbh | 4625.1 | |
| Imidazol | Carl Roth Gmbh | X998.4 | |
| NaCl | Carl Roth Gmbh | 9265.2 | |
| Yeast Extract | Carl Roth Gmbh | 2363.4 | |
| Trypton/Pepton | Carl Roth Gmbh | 8952.4 | |
| K2HPO4 | Carl Roth Gmbh | P749.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth Gmbh | 3904.1 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | 6344.2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | ||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | |
| EconoPac columns | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Sterile filter 0,22μm | Whatman, GE Healthcare | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | ||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | ||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | ||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | ||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | ||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | ||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | ||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | ||
| ESGRO (LIF) | EMD Millipore | ||
| NEAA | GIBCO, by Life Technologies | 11140035 | |
| L-Glutamin | GIBCO, by Life Technologies | 25030024 | |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 31350010 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960044 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | ||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-3367 | |
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-9387 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| X-Gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
References
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- Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
- Landry, J. R. Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver. Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).
