Summary
Dextran נתרן סולפט (DSS) מנוהל במי השתייה הוא מודל הוקמה Murine פגיעה דלקתית חריפה של קוליטיס. פרוטוקול זה מתאר את שיטת הטיפול DSS והכנת רקמות.
Abstract
קוליטיס יכולה להתרחש מפני זיהומים נגיפי או חיידקי, להעליב איסכמי, או הפרעות אוטואימוניות, קוליטיס כיבית ביותר בעיקר את גרסה הגס של מחלת קרוהן - קוליטיס קרוהן. קוליטיס חריפה עשויה להציג עם הכאב התנפחות הבטן, ספיגה, שלשולים, hematochezia וריר בצואה. אנו מתחילים להבין את יחסי הגומלין המורכבים בין הסביבה, גנטיקה, תפקוד מחסום האפיתל דלקתיות מחלות מעי חיה מודלים של קוליטיס כבר חיוני בקידום ההבנה שלנו של מחלה זו. אחת מודל פופולרי כרוך להשלים את מי השתייה של העכברים עם סולפט dextran משקל מולקולרי נמוך נתרן (DSS), וכתוצאה מכך לנזק אפיתל תגובה דלקתית חזקה במעי הגס שנמשכה כמה ימים
Protocol
חלק 1: פציעה, תיקון דגם קוליטיס
- משקל Baseline יש לקבל עבור כל עכבר לפני תחילת הטיפול DSS.
- בצע 3% (w / v) נתרן סולפט dextran מלח פתרון במים ולסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר אצטט תאית.
- החלף מי שתייה בכלוב עכבר עם פתרון DSS 3% במשך ארבעה ימים. העכברים לא צריכה להיות גישה לכל מקור מים אחר (טיפים הדרה כלומר דגש על מערכות השקיה אוטומטיות).
- ביום הרביעי, להחליף את פתרון DSS עם מים במשך שלושה ימים נוספים, ומאפשר התאוששות אפיתל המעי הגס. העכברים צריכים להישקל על ארבעה ימים על מנת לכמת את ההשלכות המערכתיות של קוליטיס. ירידה במשקל היא נפוצה עם פגיעה חמורה.
- ביום 7, לשקול להקריב את העכברים. עכברים יכולים להיות מורדמים באמצעות מנת יתר של שאיפה isoflurane, מוסדית או אחרת, אישר IACUC שיטות.
חלק 2: Necropsy והקציר של קולון
- לחשוף את הצד הגחוני של העכבר והרגליים מאובטח כדי להבטיח גישה בלא הפרעה אל הבטן. רטוב לגמרי את הבטן עם אתנול 70%.
- תפוס את קו האמצע של הבטן עם מלקחיים רקמות להאריך כלפי מעלה ובכך האהלה את העור. השתמש קנס שקצהו מספריים כדי לחתוך את הבטן ובכך חושפים את תכולת הבטן. הרחבת חתך עד קצה של תהליך xyphoid על קו האמצע ולאחר מכן להרחיב לאורך הצד הנחות של שולי costal בילטרלי.
- זהה את המעי הדק, cecum, והמעי הגס. בזהירות לנתח / להקניט את המעי הגס מן mesentery שמסביב. Transect המעי הגס עמוק בתוך האגן כדי לשחרר את המעי הגס והרקטום דיסטלי ו. Transect המעי הגס בשוליים colonocecal לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי. יש להקפיד במהלך תהליך זה לא לפגוע כמו ניקוי המעי הגס המעי הגס יהיה בעייתי אם ניקוב מתרחשת.
- באמצעות מחט האכלה 20 גרם ו - 10 מ"ל מזרק, לצנרר ולשטוף את המעי הגס עם קרים כקרח PBS עד eluate ברורה לחלוטין של צואה.
- בנקודה זו, אם ניתוח מאקרוסקופיים באמצעות מיקרוסקופ ביתור הוא הרצוי, נקודתיים יכול להיות קבוע בשם "נקניקיות". אם ניתוח היסטולוגית בלבד הרצוי מאשר להמשיך חלק 4 "ביצוע רולס שוויצרי לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה".
חלק 3: עיבוד כמו "נקניקיות" לניתוח מקרוסקופית של המעי הגס שלמים
- חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל. חותכים שתי חתיכות תפר שאינם נספגים (SP116 1.5 משי קלוע מטרי), אחד כ 1 ס"מ אורך, השני 2 אינץ.
- השתמש חתיכה של 2 ס"מ תפר לקשור את הקצה הדיסטלי קרוב לשוליים ככל האפשר, תוך שמירה חותם טוב.
- המקום מחט האכלה 20 גרם המכילה 5 מ"ל של 10% בופר פוספט פורמלין לתוך סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. Loosely לקשור את פיסת הנותרים של תפר הפרוקסימלי מיד הנורה של המחט האכלה. אחוז המעי הגס בתוקף על הנורה של המחט האכלה להזרים פורמלין עד המעי הגס מורחבת. הדקו את הקשר תפר כפי שאתה למשוך את מחט האכלה, ובכך להותיר את חדורים, המעי הגס התרחבו כמו "נקניק".
- מלא צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10% שנאגרו פוספט בפורמלין במקום המעי הגס בצינור. תקן 24 שעות.
- יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר).
- הסר את המעי הגס מהצינור חרוטי לחתוך את החוטים בכל קצה עם אזמל, נזהר לא לפגוע המעי הגס. זכרו כי בסופו הדיסטלי יש את פיסת הארוך ביותר של מחרוזת. גזור longitudinally מן דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס, כך הוא יוצר גיליון ארוך. בשלב זה, המעי הגס ניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח.
חלק 4: ביצוע רולס השוויצרית לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה
- חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל.
- מדוד את אורך המעי הגס. מדד זה מצביע פעם נוספת חומרת הפציעה. קוליטיס מעלה בצקת ומקצר את אורך המעי הגס הכוללת.
- באמצעות קנס שקצהו מספריים, לחרות longitudinally מ דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. שימוש במלקחיים היטה בסדר לתפוס או קצה של החתך פתוח רוחבית לעבוד בדרך שלך distally-> proximally, ובכך להציג את המעי הגס כמו סדין שטוח.
- רולינג המעי הגס דורש זוג מלקחיים טכניקה two ריקות. אחוז אחד לקצה השוליים דיסטלי עם מלקחיים. המשך ברצף לגלגל את המעי הגס על ידי החלפה ושחרור של מלקחיים הליך לשוליים הפרוקסימלי. לפיכך יצירת ספירלה עם מימד שלישי או "Roll השוויצרית".כדי לשמור את הטופס התגלגל, לתפוס את הגליל היטב עם מלקחיים transect זה עם מחט 27G1 / 2. Secure את המחט על ידי כיפוף המחט מיד עם יציאתו את הגליל.
- מניחים את להתגלגל קלטת רקמות שכותרתו כראוי ומניחים בצנצנת של 10% בופר פוספט פורמלין בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות על מנת להבטיח קיבוע הרקמה.
- יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר).
- לאחר מדגם תוקנה, זה יכול להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית.
חלק 5: תוצאות נציג
המודל DSS עבור קוליטיס חריפה מאפשרת לחוקר להשיג, לתקן, ולנתח נקודתיים כי מודלים קוליטיס חריפה. כאשר גליל שוויצרי נחתך רכוב, יש טופס פרוסה נציג של המעי הגס כולו אם התגלגל כראוי (איור 1). גליל רכוב יכול להיות מוכתם H & E כדי לקבוע את מידת הנזק המעי הגס, מסוף (בפנים) דיסטלי עד הסוף (בחוץ) פרוקסימלי (איור 2). אימונוהיסטוכימיה ניתן גם לבצע גליל השוויצרי לזהות ולכמת מחלחל דלקתיות. אם שיטת נקניק שבוצעה כהלכה, המעי הגס קבוע יהיה מורחבים על פני הרירית כולה ניתן להשפיע בקלות מתחת למיקרוסקופ הניתוחים (איור 3).
באיור 1. כהלכה-להורג "פחזנית". (א) המעי הגס הוא התגלגל מן דיסטלי לסיים הפרוקסימלי, transected עם מחט ומאובטחת על ידי כיפוף סופו של המחט. זה ממוקם אז קלטת רקמה קיבעון. (ב) H & E מוכתם סעיף 5 מיקרומטר של גליל השוויצרי עשוי המעי הגס של עכבר שטופלו DSS (ד = המעי הגס הדיסטלי p = המעי הגס הפרוקסימלי).
איור 2. DSS נקודתיים שטופלו להראות סימנים של דלקת חריפה. נזק דלקת הקריפטה ניכרים DSS המעי הגס שטופלו לעומת בקרת מים מטופלים.
איור 3. דוגמה "נקניק". נקניק רווי פורמלין והרחיב לחלוטין. הזווית הקלה תהיה משנית להציג עקמומיות הטבעית של המעי הגס. נקניק נפתח צריך לשכב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה יכול להיות שונה למודל פגיעה חריפה, פגיעה לתקן או פציעה כרונית תהליכים הגס.
פגיעה חריפה שינוי:
מודעה DSS טיפול lib עבור 4-6 ימים ואחריו להקריב מיידית
פגיעה, שינוי ותיקון:
פגיעה עם 4-6 ימים של טיפול DSS ואחריו תקופת החלמה של 3-4 ימים והקרבה (כפי שמתואר בפרוטוקול לעיל).
שינוי קוליטיס כרוני:
עכברים ממוקמות על שלושה מחזורים של חמישה ימים של DSS 3% עם עשר יום של התאוששות בין כל מחזור. עכברים מוקרבים לאחר תקופת 16 הימים האחרונים למנוחה.
ישנן כמה בעיות החוקרים צריכים להיות מודעים עם המודל הזה:
- השתנות באתר של פציעה: בידיים שלנו, אנחנו רואים דפוס פציעה דיסטלי בעיקר, עם חוסך יחסית של המעי הגס cecum הפרוקסימלית ומ. אחרים דיווחו דומיננטיות הפרוקסימלי יותר לדפוס פציעה.
- השתנות הסביבה. יש השתנות סביבתיים משמעותיים. זה עשוי, בין השאר, בשל ההבדלים מיקרופלורת דיאטה מעיים, ושיקולים סביבתיים אחרים.
- מודל זה אינו יעיל אם משקל מולקולרי גבוה DSS משמש (כלומר 500,000 דא).
- יש השתנות המתח ניכר עם 4 מודל זה.
אנליזה ביוכימית של המעי הגס יכול להתבצע על ידי לקיחת דגימות מן השוליים פרוקסימלי או דיסטלי. בהתאם לחומרת הפציעה זה עשוי להשפיע על היכולת שלך ליצור ציון פגיעה היסטולוגית. בשנת vivo BrdU תיוג למדוד התפשטות יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת intraperitoneal של 16.7 מיקרוגרם / ק"ג BrdU 2 שעות לפני להקריב ואחריו α-BrdU IHC עיבוד.
כחלופה "נקניק", המעי הגס ניתן לתקן שטוח לחלוטין. בשורה התחתונה של קופסת פלסטיק עם נייר Whatman ולספוג את הנייר עם 10% בופר פוספט פורמלין. לנתח את המעי הגס כמתואר "חלק 2: Necropsy והקציר של קולון". שוב, לשמור את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל. באמצעות קנס שקצהו מספריים, לחרות longitudinally מ דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. בעזרת מלקחיים היטה קנס או לתפוס קצה של החתך פתוח רוחבית עבודה, ובכך להציג את המעי הגס כמו סדין שטוח. העברה זו גיליון שטוח לנייר Whatman מראש ספוג. מכסים את המעי הגס שטוח עם חתיכה נוספת של Whatman ורטוב עם 10% בופר פוספט פורמלין. Whatman צריך להיות מכוסה לחלוטין בפורמלין אבל לא הרבה כל כך מרים את המעי הגס. החותם טאפרוור ולתקן למשך 24 שעות. הסר את המעי הגס מן טאפרוור ולמקם אותו 10 מ"ל אתנול 70% צינור חרוטי 15 מ"ל. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר).
ישנן מספר שיטות לכימות נזק הגס 5,6,7. שיטה אחת, למשל, משתמשת בקנה מידה רב פרמטר כולל: מעורבות, במידה דלקת, התחדשות, נזק הקריפטה, ומעורבות 8 אחוזים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ונדרבילט IACUC.
Acknowledgments
המימון הניתנים על ידי NIH (1 DK080221 K08-01) וקרנות ונדרבילט פיתוח מוסדיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
