Summary
Içme suyu uygulanan dekstran sülfat sodyum (DSS), akut kolit kurulmuş bir fare inflamatuar yaralanma modeli. Bu protokol, DSS tedavi ve dokuların hazırlanması için yöntemi özetlemektedir.
Abstract
- Crohn Kolit en önemlisi Ülseratif Kolit ve Crohn Hastalığı kolon varyantı; Kolit, viral ya da bakteriyel enfeksiyonlar, iskemik hakaret veya otoimmün hastalıklar ortaya çıkabilir. Akut kolit, karın ağrısı ve şişme, malabsorpsiyon, ishal, hematokezya ve dışkıda mukus ile ortaya çıkabilir. Biz çevre, genetik, ve epitelyal bariyer disfonksiyonu kolit İnflamatuar Barsak Hastalıkları ve hayvan modellerinde, bu hastalık anlayışımızı ilerleyen temel olmuştur arasındaki karmaşık etkileşimleri anlamaya başlıyor. Bir popüler model, birkaç gün süren epitelyal hasar ve kolon sağlam bir inflamatuar yanıt ile sonuçlanan farelerin içme suyu, düşük molekül ağırlıklı Dextran'ın Sodyum Sülfat (DSS) ile tamamlayan
Protocol
Bölüm 1: Sakatlık-Onarım Kolit Modeli
- Temel ağırlık DSS tedavi başlamadan önce her fare için alınmalıdır.
- % 3 (w / v) Dekstran Sülfat Sodyum Tuz su içinde çözüm ve 0.45 mikron selüloz asetat filtre filtre olun.
- Dört gün için% 3 DSS çözümü ile fare kafes içme suyu değiştirin. Fareler, başka herhangi bir su kaynağı (otomatik sulama sistemleri üzerine yerleştirilen yani dışlama ipuçları) erişim olmamalıdır.
- Günde dört, bazı kolon epitel kurtarma sağlayan, ek bir üç gün boyunca su ile DSS çözüm değiştirin. Fareler kolit sistemik sonuçları ölçmek için dört günde değerlendirilmelidir. Kilo kaybı, ağır yaralanma ile ortak.
- 7 gün, tartmak ve farelerin kurban. Fare, izofluran, ya da kurumsal diğer inhalasyon doz aşımı ötenazi olabilir, IACUC onaylı yöntemlerle.
Bölüm 2: Otopsi ve Colon Hasat
- Karın için engelsiz erişim sağlamak için, fare ve güvenli bacaklar ventral tarafta Açığa. Karın% 70 etanol ile tamamen ıslatın.
- Doku forseps ile karın orta hat kavrayın ve çadır cildi yukarı doğru uzatmak. , Karın, böylece karın içeriğini teşhir kesilirken ince uçlu makas kullanın. Insizyon orta hatta xiphoid sürecinin ucu uzatın ve sonra bilateral kot marjlarının aşağı yönü boyunca uzanan.
- Küçük bağırsak, çekum ve kolon tanımlayın. Dikkatlice disseke / çevreleyen mezenter kolon kızdırmak. Distal kolon ve rektum serbest kolon pelvis derin transect. Proksimal kolonda serbest colonocecal marjı kolon transect. Bakım, temizlik gibi perforasyon oluşursa kolon sorunlu olacaktır kolon zarar görmemesi için bu işlem sırasında alınmalıdır.
- 20G besleme iğne ve 10 ml şırınga kullanarak, entübe ve buz gibi soğuk PBS ile kolon eluat dışkı tamamen temizlenene kadar yıkayın.
- Bu noktada, bir diseksiyon mikroskobu ile makroskopik analiz isteniyorsa, iki nokta üst üste "sucuk" olarak sabit olabilir. Histolojik analiz sadece 4 "Akut Kolit Histolojik Analizi İsviçre Rolls yapma" Parça devam etmek isteniyorsa.
Bölüm 3: Tüm Colon Makroskopik Analizi "Sosis" olarak İşleme
- Kolon doğru yönde korumak için önemlidir, bu nedenle, operatöre yakın kolon distal ucundan tutun. Emilmeyen dikiş iki adet (SP116 1.5 metrik örgülü ipek), uzunluğu yaklaşık 1 inç, diğer 2 inç kesin.
- Hala iyi bir mühür korurken, mümkün olduğunca marjı yakın olarak distal ucu kapalı bağlamak için 2 inç dikiş parça kullanın.
- 5 ml% 10 içeren bir 20G besleme iğne formalin fosfat tamponlu kolon proksimal ucunu yerleştirin. Gevşek beslenme iğne ampul hemen proksimal dikiş kalan parçasını bağlar. Kolon beslenme iğne ampul sıkıca kavrayın ve kolon genişletilmiş kadar formalin demlenmeye. Böylece bir "sucuk" olarak aşılanmış, genişletilmiş kolon bırakarak, besleme iğnesi geri dikiş düğüm sıkın.
- % 10 formalin fosfat tamponlu ve tüp içinde kolon 15 ml konik tüp doldurun. 24 saat saptamak için.
- Formalin dökün ve ek bir 24 saat için% 70 EtOH ile değiştirin. Kolon (oda sıcaklığında 70% EtOH süresiz olarak saklanabilir.)
- Konik tüp kolon çıkarın ve iki nokta üst üste zarar vermemek için dikkatli olmak, bir bistüri ile her iki ucundaki dizeleri kesmek. Distal ucu dizenin en uzun parçası olduğunu unutmayın. Distal kolon proksimal sonuna kadar uzun bir sayfa oluşturur, böylece uzunlamasına kesilir. Bu noktada, iki nokta üst üste bir diseksiyon mikroskop altında görülebilir.
Bölüm 4: Akut Kolit Histolojik Analizi İsviçre Rolls yapma
- Kolon doğru yönde korumak için önemlidir, bu nedenle, operatöre yakın kolon distal ucundan tutun.
- Kolon uzunluğunu ölçün. Bu metrik yaralanma şiddeti bir başka göstergesidir. Kolit ödemi artırır ve genel kolon süresini kısaltır.
- Ince uçlu makas kullanarak, distal kolon proksimal ucuna uzunlamasına insizyon. Ince uçlu forseps, böylece düz bir levha olarak kolon kesi ya da kenarını kavramak ve distalde-> proksimalde şekilde çalışma yanlamasına açık kullanın.
- Rolling kolon forseps bir çift ve iki el tekniği gerektirir. Forseps ile distal margin iki kenarına tutun. Sırayla proksimal marjı geçmeden forseps dönen ve serbest kolon rulo geçin. Bu nedenle, üçüncü bir boyut ya da "İsviçre Roll" ile bir sarmal oluşturuyor.Haddelenmiş formunu korumak için, forseps ile sıkıca rulo kavramak ve 27G1 / 2 iğne ile transect. Rulo çıkar iğne bükerek iğne sabitleyin.
- % 10 bir kavanoza bir şekilde etiketlenmiş doku kaset ve yer rulo yerleştirin doku fiksasyonu sağlamak için oda sıcaklığında 24 saat formalin fosfat tamponlu.
- Formalin dökün ve ek bir 24 saat için% 70 EtOH ile değiştirin. Kolon (oda sıcaklığında 70% EtOH süresiz olarak saklanabilir.)
- Örnek sabit olmuştur sonra, parafine gömülü kesitli ve histolojik analiz için kızaklar üzerinde monte edilebilir.
Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar
DSS akut kolit için modeli, araştırmacı, elde, düzeltmek ve bu modelleri akut kolit kolon analiz sağlar. (Şekil 1) düzgün İsviçre rulo rulo halinde kesilir ve monte edildiğinde, tüm kolon temsili bir dilim formu gerekir. Monte rulo distal (iç) ucundan proksimal (dış) uç (Şekil 2), kolon hasarın boyutunu belirlemek için H & E ile boyanmış olabilir. İmmünohistokimya İsviçre roll inflamatuvar infiltrat belirlemek ve ölçmek için de yapılabilir. Sosis yöntemi doğru yapıldıysa, sabit kolon genişlemiş olacak ve tüm mukoza yüzeyi kolaylıkla diseksiyon mikroskobu altında (Şekil 3) manipüle ve izlenebilir.
Şekil 1 düzgün bir şekilde yürütülen "İsviçre roll". (A) kolon, distal proksimal sonuna kadar haddelenmiş bir iğne ile transeksiyon ve iğne sonuna bükme tarafından güvenli. Daha sonra, sabitlenmesi için bir doku kaset yerleştirilir. (B) H & E DSS (d = distal kolon p = proksimal kolon) ile tedavi edilen bir fare kolon yapılan bir İsviçre rulo 5 mikron bölümünde boyandı.
Şekil 2 DSS tedavi iki nokta üst üste, akut kolit belirtileri gösteriyor . Inflamasyon ve crypt zarar bir su tedavi kontrolü göre DSS ile tedavi edilen kolon açıktır.
Şekil 3 "sucuk" bir örnek. Sosis, formalin ile aşılanmış ve tamamen genişledi. Hafif bir açı kolon doğal eğrilik mevcut ikincil olacaktır. Ambalajı açılmış salam düz durmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, akut yaralanma, yaralanma-onarım veya kronik kolon yaralanma süreçlerini modellemek için modifiye edilebilir.
Akut Sakatlık Modifikasyonu:
DSS tedavi reklam lib hemen kurban takiben 4-6 gün boyunca
Sakatlık-Onarım Modifikasyon:
4-6 gün, iyileşme süresi 3-4 gün ve fedakarlık (, yukarıda protokol açıklandığı gibi) DSS tedavi ile yaralanmalara neden olabilir.
Kronik Kolit Modifikasyon:
Fareler her çevrim arasındaki on altı günde iyileşme ile% 3 DSS üç beş günlük döngülere yerleştirilir. Fare, son 16 günlük dinlenme döneminden sonra kurban.
Araştırmacılar bu model ile farkında olması gereken çeşitli sorunlar vardır:
- Yaralanma sitede Değişkenlik: bizim ellerde proksimal kolon ve çekum göreceli koruyucu, ağırlıklı olarak distal yaralanma desen görüyoruz. Diğer yaralanma desen daha proksimal üstünlüğü bildirdin.
- Çevresel değişkenliğin. Önemli çevresel değişkenliği vardır. Bu, kısmen, bağırsak mikroflorası, beslenme ve diğer çevresel hususlar farklılıklar nedeniyle muhtemeldir.
- Bu model, yüksek molekül ağırlıklı DSS (yani 500.000 Da) kullanıldığı takdirde etkisizdir.
- Bu modeli 4 ile ciddi bir gerginlik değişkenliği vardır.
Proksimal veya distal kenar örnekleri alarak kolon Biyokimyasal analizler yapılabilir. Yaralanma şiddetine bağlı olarak bu histolojik yaralanma skoru oluşturmak için yeteneğinizi etkileyebilir. In vivo BrdU çoğalması ölçmek için etiketleme α-BrdU IHC işleme takip kurban 16.7 mikrogram / kg BrdU 2 saat önce intraperitoneal tarafından elde edilebilir.
"Sosis" bir alternatif olarak, kolon tamamen düz sabit olabilir. Tupperware whatman kağıdı ile bir kabın alt ve% 10 ile kağıt emmek Hattı formalin fosfat tamponlu. Iki nokta üst üste ": Otopsi ve Colon Hasat Part 2" de açıklandığı gibi ayır. Yine, operatöre yakın kolon distal ucundan tutun. Ince uçlu makas kullanarak, distal kolon proksimal ucuna uzunlamasına insizyon. Ince uçlu forseps kesi iki kenarını kavramak ve böylece düz bir levha olarak kolon, çalışma yanlamasına açık. Bu düz sac, önceden ıslatılmış whatman kağıt aktarın. % 10 formalin fosfat tamponlu basık kolon whatman ve ıslak başka bir parça ile kaplayın. Formalinde whatman tamamen kapalı ama kolon havalandığı bu kadar fazla değil olmalıdır. Tupperware Seal ve 24 saat boyunca düzelttirmek. Tupperware kolon çıkarın ve 15 ml konik bir tüp içerisinde 10 ml% 70 etanol içine koyun. Kolon (oda sıcaklığında 70% EtOH süresiz olarak saklanabilir.)
Kolon yaralanma 5,6,7 miktarının belirlenmesi için çeşitli yöntemler vardır. Inflamasyon, ölçüde katılımı, rejenerasyon, crypt hasar ve yüzde katılımı 8: Bir yöntem, örneğin, gibi bir çok parametre ölçekli kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vanderbilt IACUC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
NIH (1 K08 DK080221-01) ve Vanderbilt kurumsal kalkınma fonları tarafından sağlanmaktadır Finansman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
