Summary
Dextransulfaat natrium (DSS) toegediend in het drinkwater is een gevestigde murine inflammatoire letsel model van acute colitis. Dit protocol beschrijft de methode voor DSS behandeling en de preparatie van de weefsels.
Abstract
Colitis kunnen het gevolg zijn van virale of bacteriële infecties, ischemische beledigen of auto-immuunziekten, met name colitis ulcerosa en de dikke variant van de ziekte van Crohn - Crohn Colitis. Acute colitis kunnen presenteren met buikpijn en buik, malabsorptie, diarree, hematochezia en slijm in de ontlasting. We beginnen de complexe interacties tussen milieu, genetica, en de epitheliale barrière dysfunctie bij inflammatory bowel disease en dierlijke modellen van colitis zijn essentieel in het bevorderen van onze kennis van deze ziekte te begrijpen. Een populair model betreft tot aanvulling van het drinkwater van muizen met een laag moleculair gewicht Dextran natriumsulfaat (DSS), wat resulteert in beschadiging van het epitheel en een robuuste ontstekingsreactie in de dikke darm meerdaagse
Protocol
Deel 1: Letsel-Repair Colitis Model
- Baseline gewicht moet worden verkregen voor elke muis voorafgaand aan het begin DSS de behandeling.
- Maak een 3% (w / v) dextraansulfaat Natrium zout-oplossing in water en filter met een 0,45 pm cellulose-acetaat filter.
- Vervang het drinkwater in de muis kooi met de 3%-DSS-oplossing voor vier dagen. De muizen zouden geen toegang tot een andere bron van water (met uitsluiting tips geplaatst op geautomatiseerde irrigatiesystemen).
- Op dag vier, vervang dan de DSS-oplossing met water voor een extra drie dagen, waardoor een aantal dikke epitheliale herstel. De muizen moeten worden afgewogen op dag vier, om systemische gevolgen van colitis kwantificeren. Gewichtsverlies is vaak met ernstig letsel.
- Op dag zeven, wegen en opoffering van de muizen. Muizen kunnen worden gedood door inhalatie-overdosis van isofluraan, of een ander institutioneel, IACUC goedgekeurde methoden.
Deel 2: autopsie en oogsten van Colon
- Expose de ventrale zijde van de muis en veilige benen om onbelemmerde toegang tot de buik te verzekeren. Volledig nat de buik met 70% ethanol.
- Pak de middellijn van de buik met weefsel pincet en zo naar boven uit te breiden tenten van de huid. Gebruik fijne punt schaar om de buik waardoor het blootstellen van de buikinhoud incise. Uitbreiding van de incisie aan de top van de xyphoid proces op de middenlijn en dan zich langs de inferieure aspect van de ribben marges bilateraal.
- Identificeer de dunne darm, blindedarm en dikke darm. Zorgvuldig te ontleden / plagen de dikke darm van de omringende mesenterium. Transect de dikke darm diep in het bekken naar het distale colon en het rectum vrij. Transect de dikke darm bij de colonocecal marge naar de proximale dikke darm vrij. Zorg moet worden genomen tijdens dit proces niet aan de dikke darm beschadigen als het reinigen van de dikke darm zal problematisch zijn als perforatie optreedt.
- Met behulp van een 20G naald voeden en 10 ml spuit, intuberen en spoel de dikke darm met ijskoude PBS, totdat het eluaat volledig vrij van ontlasting.
- Op dit punt, als macroscopische analyse met een dissectiemicroscoop gewenst is, kan de dubbele punten worden vastgesteld als "worst". Als histologische analyse alleen gewenst is dan verder met deel 4 "Het maken van Zwitserse Rolls voor de histologische analyse van acute colitis".
Deel 3: Verwerking als "worst" voor Macroscopische Analyse van de gehele dikke darm
- Het is belangrijk om de juiste stand van de dikke darm te behouden, dus houd het distale uiteinde van de dikke darm het dichtst bij de operator. Knip twee stukken van de niet-resorbeerbaar garen (SP116 1,5 metrische gevlochten zijde), een ongeveer 1 cm in lengte, de andere 2 centimeter.
- Gebruik het 2 inch stukje hechtdraad tot afhechten het distale einde zo dicht mogelijk bij de marge mogelijk met behoud van een goede afdichting.
- Plaats een 20G naald voeden met 5 ml 10% gebufferde formaline fosfaat in het proximale uiteinde van de dikke darm. Losjes binden de resterende stuk van hechtdraad onmiddellijk proximaal van de lamp van de voeding naald. Pak altijd de dikke darm aan de lamp van de voeding naald en bezielen formaline tot de dikke darm is uitgebreid. Draai de knoop in de hechtdraad als je terug te trekken de voeding naald, waardoor het de toegediende, uitgebreide dikke darm als een "worst".
- Vul een 15 ml conische buis met 10% gebufferde formaline fosfaat en plaats van de dikke darm in de buis. Fix voor 24 uur.
- Giet formaline en te vervangen door 70% EtOH voor een extra 24 uur. (Dubbele punten kunnen worden opgeslagen in 70% EtOH voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.)
- Verwijder de dikke darm uit de conische buis en snijd de snaren op elk uiteinde met een scalpel, zorg dat u de dikke darm beschadigen. Vergeet niet dat het distale uiteinde van de langste touwtje heeft. Gesneden lengterichting van het distale tot proximale uiteinde van de dikke darm, zodat het vormt een lang vel. Op dit punt kan de dikke darm worden bekeken onder een microscoop dissectie.
Deel 4: Het maken van Zwitserse Rolls voor de histologische analyse van acute colitis
- Het is belangrijk om de juiste stand van de dikke darm te behouden, dus houd het distale uiteinde van de dikke darm het dichtst bij de operator.
- Meet de dikke darm lengte. Deze statistiek is een andere indicator van de ernst van letsel. Colitis verhoogt oedeem en verkort de totale lengte dikke darm.
- Met behulp van fijne punt schaar, lengterichting incise van distaal naar proximaal uiteinde van de dikke darm. Gebruik fijn getipt tang om de randen van de incisie te begrijpen en zijwaarts te openen werkt je weg distaal-> proximaal, waardoor de weergave van de dikke darm als een vlakke plaat.
- Rollen van de dikke darm is een tang en een twee handen techniek. Pak de randen van het distale marge met een tang. Ga verder naar de dikke darm sequentieel rollen door draaien en loslaten wordt de tang te gaan tot de proximale marge. Dus het genereren van een spiraal met een derde dimensie of "Zwitserse Roll".Voor behoud van de opgerolde vorm, stevig vastpakken de rol met een tang en transect met een 27G1 / 2 naald. Zet de naald door het buigen van de naald als het wordt uitgevoerd de rol.
- Leg de rol in een passend label weefsel cassette en plaats in een pot van 10% fosfaat gebufferde formaline bij kamertemperatuur gedurende 24 uur tot weefsel fixatie te garanderen.
- Giet formaline en te vervangen door 70% EtOH voor een extra 24 uur. (Dubbele punten kunnen worden opgeslagen in 70% EtOH voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.)
- Nadat het monster is vastgesteld, kan het paraffine ingebedde, gesegmenteerd en gemonteerd op dia's voor histologische analyse.
Deel 5: representatieve resultaten
De DSS-model voor acute colitis kan de onderzoeker te verkrijgen, repareren, en een dubbele punt dat modellen acute colitis te analyseren. Als de Zwitserse rol wordt gesneden en gemonteerd, moet het vormen een representatief deel van de gehele dikke darm als gerold goed (figuur 1). De gemonteerde roll kan worden gekleurd met H & E in om de omvang van de schade vast te stellen in de dikke darm, vanaf het distale (binnen) einde aan de proximale (buiten) uiteinde (figuur 2). Immunohistochemie kan ook worden uitgevoerd op de Zwitserse rol te identificeren en te kwantificeren inflammatoire infiltraten. Als de worst methode correct is uitgevoerd, zal de vaste colon verwijd en de hele mucosale oppervlak kan gemakkelijk worden gemanipuleerd en bekeken onder de microscoop te ontleden (figuur 3).
Figuur 1. De goed uitgevoerde "Zwitserse roll". (A) De dikke darm is gerold van de distaal van proximale uiteinde, doorsneden met een naald en beveiligd door het buigen aan het einde van de naald. Het wordt dan geplaatst in een weefsel cassette voor bevestiging. (B) H & E-lood 5 micrometer doorsnede van een Zwitserse broodje gemaakt van de dikke darm van een muis die behandeld worden met DSS (d = distale colon p = proximale colon).
Figuur 2. DSS behandeld dubbele punten vertonen tekenen van acute colitis. Ontsteking en crypte schade zijn duidelijk zichtbaar in de DSS-behandelde dikke darm in vergelijking met een water-behandelde controle.
Figuur 3. Een voorbeeld van een "worst". De worst doordrenkt met formaline en volledig uitgebreid. Een lichte hoek zal aanwezig zijn ondergeschikt aan de natuurlijke kromming van de dikke darm. De geopende worst moet plat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol kan worden aangepast om acuut letsel, letsel-reparatie, of chronische colon letsel te modelleren.
Acuut letsel Wijziging:
DSS behandeling ad lib voor 4-6 dagen gevolgd door onmiddellijke offer
Injury-Repair Modification:
Letsel met 4-6 dagen van DSS-behandeling gevolgd door herstel periode van 3-4 dagen en opoffering (zoals beschreven in bovenstaande protocol).
Chronische Colitis Wijziging:
Muizen zijn geplaatst op drie vijf-dagen cycli van 3% DSS met zestien dagen van herstel tussen elke cyclus. Muizen zijn opgeofferd na de laatste 16-daagse rustperiode.
Er zijn verschillende problemen die onderzoekers moeten zich bewust zijn van zijn met dit model:
- Variabiliteit in plaats van het letsel: In onze handen, zien we een overwegend distale patroon van verwondingen, met een relatieve sparen van de proximale dikke darm en de blindedarm. Anderen hebben gemeld meer proximale overwicht om de schade patroon.
- Milieu-variabiliteit. Er is significante milieu-variabiliteit. Dit is waarschijnlijk voor een deel te wijten aan verschillen in de intestinale microflora, voeding en andere milieu-overwegingen.
- Dit model is niet effectief als een hoog moleculair gewicht DSS wordt gebruikt (dwz 500.000 Da).
- Er is veel druk variabiliteit met dit model 4.
Biochemische analyse van de dikke darm kan worden uitgevoerd door het nemen van monsters uit de proximale of distale marges. Afhankelijk van de ernst van de verwonding kan dit invloed op uw vermogen om een histologisch blessure score te genereren. In vivo BrdU etikettering om proliferatie te meten kan worden bereikt door intraperitoneale injectie van 16,7 ug / kg BrdU twee uur voorafgaand aan de te offeren, gevolgd door α-BrdU IHC verwerking.
Als alternatief voor de "worst", kan de dikke darm worden vastgesteld volledig vlak. Bekleed de bodem van een Tupperware bak met Whatman papier en geniet van het papier met 10% gebufferde formaline fosfaat. Ontleden de dikke darm, zoals beschreven in "Deel 2: autopsie en oogsten van Colon '. Nogmaals, houd het distale uiteinde van de dikke darm het dichtst bij de operator. Met behulp van fijne punt schaar, lengterichting incise van distaal naar proximaal uiteinde van de dikke darm. Met fijne getipt pincet greep de randen van de incisie en open zijwaarts werken, waardoor de weergave van de dikke darm als een vlakke plaat. Breng deze vlakke plaat aan de pre-geweekte Whatman papier. Bedek de geplette dikke darm met een ander stuk Whatman en nat met 10% gebufferde formaline fosfaat. De Whatman moet volledig worden gedekt in formaline, maar niet zoveel dat hij vrij in de dikke darm. Sluit de Tupperware en fix voor 24 uur. Verwijder de dikke darm van de Tupperware en plaats het in 10 ml 70% ethanol in een 15 ml conische buis. (Dubbele punten kunnen worden opgeslagen in 70% EtOH voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.)
Er zijn verschillende methoden voor het kwantificeren van colon letsel 5,6,7. Een methode, bijvoorbeeld, maakt gebruik van een multi-parameter schaal, waaronder: ontsteking, omvang betrokkenheid, vernieuwing, crypte schade, en de betrokkenheid procent 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Vanderbilt IACUC in te stellen.
Acknowledgments
Financiering door NIH (1 K08 DK080221-01) en de Vanderbilt institutionele ontwikkeling fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
