Summary
Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.
Abstract
Colite pode ocorrer por infecções virais ou bacterianas, insulto isquêmico, ou doenças auto-imunes; Colite Ulcerativa e mais notadamente a variante do cólon da doença de Crohn - Colite de Crohn. Colite aguda podem apresentar dor abdominal e distensão, má absorção, diarréia, hematoquezia e muco nas fezes. Estamos começando a entender as complexas interações entre o meio ambiente, genética e disfunção da barreira epitelial em modelos de doença inflamatória intestinal e animal de colite têm sido essenciais para fazer avançar a nossa compreensão da doença. Um modelo popular envolve completando a água potável de camundongos com sulfato de baixo peso molecular de sódio Dextran (DSS), resultando em danos epiteliais e uma resposta robusta inflamatória no cólon de vários dias
Protocol
Parte 1: Lesão Modelo de Colite
- Peso inicial deve ser obtido para cada rato antes do início do tratamento DSS.
- Fazer uma de 3% (w / v) Sulfato de Dextran solução de sal de sódio em água e filtrar com um filtro de 0,45 mM de acetato de celulose.
- Substituir a água potável na gaiola do rato com a solução DSS 3% por quatro dias. Os ratos não devem ter acesso a qualquer outra fonte de água (ou seja, a exclusão dicas colocados em sistemas de rega automática).
- No dia quatro, substitua a solução DSS com água por mais três dias, permitindo alguma recuperação do cólon epiteliais. Os ratos devem ser pesados no dia quatro, a fim de quantificar conseqüências sistêmicas da colite. Perda de peso é comum com ferimentos graves.
- No dia 7, pesar e sacrifício dos ratos. Ratos podem ser sacrificados por overdose inalatória de isoflurano, ou outros institucionalmente, IACUC métodos aprovados.
Parte 2: Necropsia e Colheita de Colon
- Expor o lado ventral do rato e pernas seguro para garantir o acesso livre para o abdômen. Molhar o abdômen completamente com álcool 70%.
- Segure a linha média do abdómen com uma pinça e estender para cima, assim tenting a pele. Use uma tesoura de ponta fina para o abdômen inciso expondo o conteúdo abdominal. Estender a incisão para a ponta do apêndice xifóide na linha média e depois estender ao longo do aspecto inferior das margens costal, bilateralmente.
- Identificar o intestino delgado, ceco e cólon. Dissecar cuidadosamente / provocação do cólon a partir do mesentério circundante. Transecto do cólon profundamente na pelve, para libertar o cólon distal e reto. Transecto os dois pontos na margem colonocecal para libertar o cólon proximal. Cuidados devem ser tomados durante este processo para não danificar o colon como a limpeza do cólon será problemático se ocorrer perfuração.
- Utilizando uma agulha 20G alimentação e seringa de 10 ml, entubar e lave o cólon com gelado PBS até que o eluido está completamente limpa de fezes.
- Neste ponto, se a análise macroscópica com um microscópio de dissecação é desejado, os dois pontos podem ser fixados como "lingüiça". Se a análise histológica é apenas desejável do que prosseguir para a Parte 4 "Fazendo Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda".
Parte 3: Processamento como "Lingüiça" para análise macroscópica de todo o cólon
- É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. Corte dois pedaços de sutura não absorvível (SP116 1,5 seda trançada métricas), uma polegada de aproximadamente 1 em comprimento, os outros 2 polegadas.
- Use a peça 2 polegada de sutura para amarrar a extremidade distal mais próximo à margem quanto possível, mantendo uma boa vedação.
- Coloque uma agulha 20G alimentação contendo 5 ml de tampão fosfato 10% de formol na extremidade proximal do cólon. Vagamente empate a parte restante da sutura imediatamente proximal ao bulbo da agulha de alimentação. Segure firmemente os dois pontos no bulbo da agulha de alimentação e infundir formalina até o cólon é expandido. Apertar o nó na sutura que você retire a agulha de alimentação, deixando a infusão de cólon, expandiu como um "salsicha".
- Encha um tubo de 15 ml com 10% de fosfato tamponada de formalina e coloque os dois pontos no tubo. Correção para 24 horas.
- Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
- Remova os dois pontos do tubo cônico e cortou as cordas em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o colon. Lembre-se que a extremidade distal tem o maior pedaço de corda. Corte longitudinal do distal para extremidade proximal do cólon para que forme uma longa folha. Neste ponto, o cólon pode ser visto sob um microscópio de dissecação.
Parte 4: Making Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda
- É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador.
- Meça o comprimento do cólon. Esta métrica é um indicador da gravidade da lesão. Colite aumenta edema e encurta o comprimento do cólon em geral.
- Usando uma tesoura de ponta fina, inciso longitudinalmente de distal para proximal final do cólon. Use uma pinça bem cotado para agarrar a borda da incisão e aberto lateralmente trabalhando o seu caminho distalmente-> proximalmente, assim, mostrando o cólon como uma folha plana.
- Rolando o cólon exige um par de fórceps e uma técnica de duas mãos. Segure a borda da margem distal com uma pinça. Proceder à seqüencialmente rolo do cólon através da rotação e liberando a pinça de prosseguir para a margem proximal. Gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou "Swiss roll".Para manter a forma rolada, segure o rolo com firmeza com uma pinça e transectos com uma agulha 27G1 / 2. Segura a agulha, dobrando a agulha que sai do rolo.
- Coloque o rolo em uma fita de tecido devidamente rotulados e coloque em um frasco de 10% de fosfato tamponada de formol em temperatura ambiente por 24 horas para garantir a fixação do tecido.
- Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
- Uma vez que a amostra foi corrigido, ele pode ser incluído em parafina, seccionado e montado em lâminas para análise histológica.
Parte 5: Resultados Representante
O modelo DSS para a colite aguda permite ao pesquisador obter, corrigir e analisar dois pontos que a colite aguda modelos. Quando o rolo suíço é cortado e montado, ele deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se rolou corretamente (Figura 1). O rolo montado podem ser marcadas com H & E, a fim de determinar a extensão dos danos para o cólon, desde o final (para dentro) distal até o final (fora) proximal (Figura 2). Imunohistoquímica também pode ser realizada no rolo suíço para identificar e quantificar infiltrados inflamatórios. Se o método de lingüiça foi realizado corretamente, os dois pontos fixos será dilatada e toda a superfície da mucosa pode ser facilmente manipulado e visto sob o microscópio de dissecação (Figura 3).
Figura 1. Corretamente executados "Swiss roll". (A) Os dois pontos são rolados do distal para proximal final, seccionado com uma agulha e garantidos por dobrar a ponta da agulha. Em seguida, é colocada em um cassete de tecido para fixação. (B) H & E manchada seção 5 mM de um rocambole feito a partir do cólon de um rato tratados com DSS (d = cólon distal p = cólon proximal).
Figura 2. Colons DSS tratados mostrar sinais de colite aguda. Inflamação e danos cripta são aparentes no cólon DSS-tratados em comparação com um controle de água tratada.
Figura 3. Um exemplo de uma "salsicha". A salsicha infundido com formalina e completamente expandidas. Um leve ângulo estará presente secundária à curvatura natural do cólon. A salsicha aberta deve estar nivelado.
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Discussion
Este protocolo pode ser modificado para modelo de lesão aguda, lesão de reparação, ou crônica processos de lesão do cólon.
Modificação lesão aguda:
DSS ad lib tratamento para 4-6 dias, seguido pelo sacrifício imediato
Lesão-Modificação:
Lesões com 4-6 dias de tratamento DSS seguido por período de recuperação de 3-4 dias e sacrifício (como descrito no protocolo acima).
Modificação colite crônica:
Os ratos são colocados em três ciclos de cinco dias de DSS 3% com 16 dias de recuperação entre cada ciclo. Os ratos são sacrificados após o período de descanso final de 16 dias.
Há várias questões que os pesquisadores precisam estar conscientes de com este modelo:
- Variabilidade no local da lesão: Em nossas mãos, vemos um padrão de lesão predominantemente distal, com relativa preservação do cólon proximal e ceco. Outros relataram predominância mais proximal ao padrão de lesão.
- Variabilidade ambiental. Existe uma variabilidade ambiental significativo. Isto é provável, em parte, devido a diferenças na microflora intestinal, dieta e outras considerações ambientais.
- Este modelo é ineficaz se DSS de alto peso molecular é usada (ou seja, 500.000 Da).
- Existe uma variabilidade considerável pressão com este modelo de 4.
Análise bioquímica do cólon pode ser realizada através de amostras a partir das margens proximal ou distal. Dependendo da gravidade da lesão isto pode afetar sua capacidade de gerar um escore de lesão histológica. In vivo BrdU rotulagem para medir a proliferação pode ser alcançado por meio de injeção intraperitoneal de 16,7 mg / kg BrdU 2 horas antes do sacrifício seguido de processamento de IHC α-BrdU.
Como uma alternativa para a "salsicha", o cólon pode ser corrigido totalmente plana. Linha de fundo de um recipiente com papel Whatman Tupperware e aproveitar o papel com 10% de fosfato tamponada de formol. Dissecar o cólon conforme descrito em "Parte 2: Necropsia e Colheita de Colon". Novamente, mantenha a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. Usando uma tesoura de ponta fina, inciso longitudinalmente de distal para proximal final do cólon. Com finas pinças de ponta agarrar a borda da incisão e aberto lateralmente de trabalho, assim mostrando o cólon como uma folha plana. Transferir esta folha plana para o papel Whatman pré-embebidas. Cobrir o cólon achatada com outro pedaço de Whatman e úmido, com 10% de fosfato tamponada de formol. A Whatman deve ser completamente coberta em formalina, mas não tanto que decola do cólon. Selar a Tupperware e correção para 24 horas. Remova os dois pontos da Tupperware e colocá-lo em 10 ml de etanol 70% em um tubo de 15 ml. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
Existem vários métodos para quantificar lesão colônica 5,6,7. Um método, por exemplo, usa uma escala multi-parâmetros, incluindo: inflamação extensão, o envolvimento, a regeneração, os danos cripta, ea participação de 8 por cento.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Vanderbilt IACUC.
Acknowledgments
Financiamento fornecido pelo NIH (1 K08 DK080221-01) e fundos de desenvolvimento institucional Vanderbilt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
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- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
