Summary
Демонстрация изоляции новорожденных мышей спинного мозга для электрофизиологических исследований.
Abstract
Новорожденных мышей спинного мозга представляет собой модель для изучения развития нейронных схемотехника и опорно-двигательного движения. Мы показываем, спинного мозга и рассечение подготовке записи ванны искусственного спинномозговой жидкости используются для опорно-двигательного исследований. После рассеченные, спинного мозга вентральной нервных корешков может быть присоединен к записи электродов для записи электрофизиологических сигналов центральной схемы создания картины в поясничном мозга.
Protocol
1. Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) 1. Мы сначала подготовить 2 л 10X запас aCSF без магния и кальция. Реагенты, перечисленные в миллимолярных. Каталог цифры относятся к Sigma / Aldrich.
| 2 литра 10X aCSF (без Mg или Ca) | |||
| Реагент | мМ | g/2L | Каталог |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Глюкоза | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Добавить дистиллированной водой до 2 л | |||
Мы также будем готовить 1М растворов MgSO 4 и CaCl 2 в 50 мл воды, чтобы обеспечить корректировку молярность от эксперимента к эксперименту и обеспечить кальция остается в растворе.
| 1M кальция и магния Акции | |||
| Реагент | М | g/50mL | Каталог |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
Решение aCSF должны быть отравлены газом с карбогена (95% О2 / 5% СО2), чтобы снизить рН перед добавлением кальция или кальция будет выпадать в осадок.
| 1 литр aCSF | |
| Реагент | Объем |
| 10X aCSF | 100 мл |
| 1М CaCl 2 | 1 мл (рассечение) 2 мл (запись) |
| 1M MgSO 4 | 1 мл |
| Добавить ~ 800 мл дистиллированной воды, газа с карбогена в течение 2 минут перед добавлением кальция | |
| Добавить дистиллированной водой до 1 л. | |
Насосы и насосно-компрессорные и рассекает блюда должны быть промыты до и после использования.
Рассечение
Хотя рассекает, 1мМ кальция aCSF следует постоянно газом с карбогена. ACSF можно перекачать из бутылки рассекает блюдо и перекачивается из рассекает блюдо к бутылке или отправлены в отходы. Мы используем эластомер (Sylgard, Dow Corning), покрытых блюдо выполнить рассечение.
Новорожденных мышей быстро обезглавленный с острыми ножницами и разрез, сделанный с помощью ножниц по вентральной грудной клетки и живота. Животное тогда потрошился. Потрошился мыши промывается aCSF. Животное тогда возлагали на вскрытии блюдо с насекомыми контактов вводится через передние конечности и у основания хвоста.
Позвоночника снимается, выполняя вентральной ламинэктомия. Позвоночника проводится с небольшими щипцами и один лезвие маленькие ножницы вставляется спины сразу костлявые позвоночника. Пластинки разрезается на одной стороне, а затем другие, мягко подъема костлявые позвоночника. Это осуществляется по длине позвоночника.
Спинного мозга удаляется путем разрезания вдоль обеих сторон спинного мозга разорвать корешки спинномозговых нервов и сократить мозговых оболочек окружающих спинной мозг. Режем на левой и правой сторон, то мы сократим мозговые оболочки прикреплен к спинной стороне спинного мозга, чтобы освободить его. Изолированных шнур затем возлагали на блюдо рядом с входом aCSF для обеспечения хорошей оксигенации, если дополнительные животные расчленены.
Изолированных спинного мозга, затем переведен в записи блюдо с помощью небольшого ложкой или лопаточкой. Здесь мы заливать препарат с кислородом кальция 2 мМ aCSF. Спинной мозг прижат к эластомера покрытием блюдо и микроманипуляторами используются для перемещения внеклеточной, целые электродов всасывания корневого возле корней. Когда электрод находится вблизи свободного конца корня, нежное всасывание применяется привлечь внедряются в всасывающего электрода. Этот процесс может быть повторен для записи несколько корней одновременно.
Рисунок 1. Обезглавливание и Evisceration. A. Быстро обезглавить мышь с острыми ножницами. Больше или меньше взносов ствола мозга может быть достигнуто в зависимости от уровня среза. B. Место один лезвие ножниц в отверстие грудной полости созданные обезглавливание. Открытое вентральной грудной клетки и брюшной полости до основания хвоста. Удалите внутренности и промыть aCSF.
Рисунок 2. Удаление позвоночника. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга справа от спинного мозга и прорезают кости прокладки брюшной части мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга, слева от спинного мозга и разреза. Б. Повторите эту процедуру при применении нежной тяги к позвоночнику. Будьте осторожны, не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом.
Рисунок 3. Удаление спинного мозга. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости справа от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости слева от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. B. Наконец, осторожно поднимите ростральной мозга и мозговых оболочек вырезать подключения спинной мозг к пластинок. Снова старайтесь не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом. Ничего не вырезано корни слишком близко к спинному мозгу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изолированных новорожденных спинного мозга обеспечивает послушный метод изучения нервной системы развитию1, 2. В поясничного спинного мозга у новорожденных грызунов, центральный схемы генерации картина может производить фиктивные передвижения в присутствии медиаторов. Это фиктивный передвижения состоит из ритмических увеличение активности, всплески, которые производятся на 0,2 до 0,5 Гц. Эти всплески организованной производить влево-вправо чередования по длине шнура и сгибателей-разгибателей чередование (ипсилатерального относительной L2 до L5). Некоторые генетические мутации у мышей было показано, что аномальное поведение 3-5. Понимание того, как нервной системы спинного мозга изменяется в процессе развития и генетические возмущения будут информировать исследования нервной системы в другом месте в ЦНС.
Следует отметить, что Есть несколько стандартных решений aCSF в регулярном использовании. Ниже приводится таблица наиболее часто используемых подготовки aCSF.
Таблица 1: Общие Композиции aCSF
| Лаборатория | aCSF Композиция в мМ |
| Пфафф, О'Донован, Landmesser (3) | 128 NaCl, KCl 4, 1,5 CaCl 2, 1 4 MgSO, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 глюкозы. |
| Гулдинг, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3,08, 2,52 CaCl 2, 1,25 4 MgSO, 1.18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 глюкозы |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, KCl 1.9-3.9, 1.2 KH 2 PO 4, 2,4 2 CaCl, MgCl 1,3 2, 26 NaHCO 3, 10 глюкозы |
| Зискинд-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, KCl 3, 1 CaCl 2, 6 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 глюкозы |
| Зискинд-Conhaim внеклеточной (7) | 113 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 глюкозы. |
| О'Донован, нут (8,9) | 139 NaCl, KCl 2.9-5, 17 3 NaHCO, 1 2 MgCl, 3 CaCl 2, 12 глюкозы |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Animal Care
Acknowledgments
Сэмюэл Л. Пфафф является профессором в лаборатории экспрессии генов в Солка института биологических исследований и следователь в Медицинского института Говарда Хьюза. Эта работа была поддержана Кристофера и Даны Рив Foundation. Джо Belcovson, Кент Schnoeker и Майк Салливан в мультимедийных ресурсов в Институте Солка оказана помощь с фотографией и редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
