Summary
Elektrofizyolojik çalışmalar için yenidoğan fare omurilik izolasyonu bir gösteri.
Abstract
Yenidoğan fare omurilik sinir circuitries ve lokomotor hareketin gelişimi eğitimi için bir modeldir. Biz spinal kord diseksiyon ve lokomotor çalışmaları için kullanılan kayıt banyo yapay beyin omurilik sıvısı hazırlanması göstermektedir. Disseke, omurilik ventral sinir kökleri lomber kord içinde merkezi desen üreten devre elektrofizyolojik sinyaller kaydetmek için bir kayıt elektrot bağlı olabilir.
Protocol
1. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) 1 hazırlayın. Biz ilk magnezyum veya kalsiyum olmadan aCSF 10X stok 2L hazırlamak. Reaktifler millimolar listelenir. Katalog numaraları Sigma / Aldrich bakın.
| 2 Litre 10X aCSF (Mg veya Ca olmadan) | |||
| Reaktif | mM | g/2L | Katalog |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Glikoz | 300 | 108,12 | D-9434 |
| 2L distile su ekleyin | |||
Ayrıca, deney deney yapmak molarite ayarlamalar için izin 50ml su MgSO 4 ve CaCl 2 1M çözümler hazırlamak ve kalsiyum çözelti içinde kalmasını sağlamak için .
| 1M Kalsiyum ve Magnezyum Stoklar | |||
| Reaktif | M | g/50mL | Katalog |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
ACSF çözüm çökelek kalsiyum veya kalsiyum eklemeden önce pH düşük carbogen (% 95 O2 /% 5 CO2) ile gaz verilerek olmalıdır.
| 1 Litre aCSF | |
| Reaktif | Hacim |
| 10X aCSF | 100 mL |
| 1M CaCl 2 | 1 ml (diseksiyon) 2mL (kayıt) |
| 1M MgSO 4 | 1 ml |
| Kalsiyum eklemeden önce ~ 800 mL distile su, 2 dakika süreyle carbogen gaz ekle | |
| 1L distile su ekleyin. | |
Pompaları ve tüp ve diseksiyon yemekleri kullanımdan önce ve sonra durulanmalıdır.
Diseksiyon
Diseksiyon iken, 1mm kalsiyum aCSF sürekli carbogen ile gaz verilerek olmalıdır. ACSF bir şişe diseksiyon çanak hortumlandığını ve şişe diseksiyon çanak pompalanır veya atık gönderilen olabilir. Biz bir elastomer (Sylgard Dow Corning) diseksiyon kaplı çanak kullanın.
Yenidoğan fare hızla, keskin bir makas ve makas ile ventral göğüs kafesi ve karın yoluyla yapılan bir kesi ile dekapite. Hayvan sonra boşaltılmış. Parçalanmış fare aCSF ile durulanır. Hayvan daha sonra, ön ayakları ile kuyruk dibinde eklenen böcek iğneli diseksiyon çanak tutturulmuş.
Omurga ventral laminektomi gerçekleştirerek kaldırılır. Omurga küçük forseps ile düzenlenen ve küçük bir makas, bir bıçak, kemikli omuriliğe hemen sırt eklenir. Lamina kemik spinal sütun hafifçe kaldırırken bir tarafında ve diğer kesilir. Bu omurganın uzunluğu için yapılmaktadır.
Omurilik, spinal sinir köklerini koparmaya ve omuriliği saran meninksler kesmek için, omuriliğin her iki tarafında boyunca kesim tarafından kaldırılır. Biz, sağ ve sol tarafta kesim, daha sonra serbest omuriliğin dorsal tarafına bağlı meninksler kesti. Izole kablosu, daha sonra iyi oksijenasyon sağlamak için ek hayvanlar disseke aCSF giriş yakınındaki çanak tutturulmuş.
Izole spinal kord sonra küçük bir kaşık veya spatula kullanarak kayıt çanak aktarılır. Burada oksijenli 2mm kalsiyum aCSF hazırlık serpmek. Omurilik elastomer kaplı çanak ve köklere yakın ekstrasellüler, bütün kök emme elektrotlar taşımak için kullanılan mikromanipülatörler tutturulmuş. Elektrot ucu serbest kök sonuna yakın, nazik emiş emme elektrot içine kök çekmek için uygulanır. Bu süreç, aynı anda birden fazla kökleri kaydetmek için tekrar edilebilir.
Şekil 1. Decapitation ve eviserasyon A. Hızla keskin bir makas ile fare başını kesmek. Beyin sapı az ya da çok katkıları kesme düzeyine bağlı olarak elde edilebilir. Dekapitasyon tarafından oluşturulan göğüs boşluğunun açılması makas B. Place bir bıçak. Ventral toraks ve karın, kuyruk tabanına açın. Organlar çıkarın ve aCSF ile durulayın.
Şekil 2. Omurilik A. kaldırılması Makas, spinal kord ve kord ventral döşeme kemikler yoluyla kesilen sağ spinal kolon ve spinal kord arasındaki boşluğa sol bıçak yerleştirin. Sonra, belkemiği ve omurilik, omurilik ve kesme sol arasındaki boşluğa makas sağ bıçak yerleştirin. B. omuriliğe nazik çekiş uygularken bu işlemi tekrarlayın. Makas düşük bir açıyla tutarak ponksiyon spinal kord dikkat edin.
Şekil 3. Omurilik kaldırılması A.. Makas omurilik ve kablosunu yan döşeme spinal kökleri ve meninks ile omurilik ve kesme hakkı kemikleri arasındaki boşluğa sol bıçak yerleştirin. Sonra, omurilik ve kemikleri arasındaki boşluk içine makas omurilik sol sağ bıçağının ve kablosunu yanal döşeme spinal kökleri ve meninks kesti. B. Ve son olarak rostral kord yavaşça kaldırın ve lamina dorsal kablonun meninksler kesmek. Yine, düşük bir açıyla makas tutarak ponksiyon spinal kord umurumda değil. Omuriliğe çok yakın kökleri kesmeyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Izole yenidoğan omurilik, sinir sistemi development1, 2 eğitim uysal bir yöntem sağlar. Neonatal kemirgenler lomber spinal kord içinde, merkezi desen üreten devre nörotransmitterlerin varlığı kurgusal lokomosyon üretebilir. Bu kurgusal lokomosyon 0,2 - 0,5 Hz üretilmektedir ritmik artar, aktivite patlamaları, oluşur. Bu patlamaları kablosu ve fleksör-ekstansör münavebe (L5 ipsilateral L2 akrabası) uzunluğu boyunca sol-sağ arda üretmek için organize edilir. Anormal davranış 3-5 farelerde bazı genetik mutasyonlar gösterilmiştir. Omurilik sinir devresi, gelişme ve genetik tedirginlikler sırasında nasıl değiştirdiğini anlamak başka MSS sinir devresi çalışmaları bilgilendirecektir.
Düzenli kullanımı birçok standart aCSF çözümler olduğuna dikkat çekmektedir. Aşağıda yaygın olarak kullanılan aCSF hazırlıkları bir tablodur.
Tablo 1: Yaygın aCSF Kompozisyonlar
| Laboratuvar | mM aCSF Kompozisyon |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1.5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0.5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 glikoz. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3.08, 2.52 CaCl 2, 1,25 MgSO 4, 1.18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 glukoz |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, 1,9-3,9 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 2.4 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 glukoz |
| Ziskind Conhaim Diseksiyon (7) | 113 NaCl, 3 KCl, CaCl 1, 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukoz |
| Ziskind-Conhaim Ekstrasellüler (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glikoz. |
| O'Donovan, civciv (8,9) | 139 2,9-5 KCl, NaCl, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 glukoz |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HAYVAN BAKIMI
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff Salk Biyolojik Araştırmalar Enstitüsü Gen İfadesi Laboratuvarlarında Profesör ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Araştırmacı. Bu çalışma, Christopher ve Dana Reeve Vakfı tarafından desteklenmiştir. Joe Belcovson, Kent Schnoeker Multimedya Kaynakları ve Salk Enstitüsü'nden Mike Sullivan, fotoğraf ve düzenleme ile ilgili yardım sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
