Summary
Une démonstration de l'isolement de la moelle épinière de souris néonatales pour des études électrophysiologiques.
Abstract
Le cordon de souris néonatales épinière est un modèle pour étudier le développement des circuits de neurones et le mouvement locomoteur. Nous démontrons la dissection de la moelle épinière et la préparation du bain d'enregistrement artificielle liquide céphalorachidien utilisés pour des études de locomotion. Une fois disséqué, les racines nerveuses moelle épinière ventrale peut être attaché à une électrode d'enregistrement pour enregistrer les signaux électrophysiologiques des circuits générant motif central de la moelle lombaire.
Protocol
1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) 1. Nous avons d'abord préparer un 2L d'un stock de 10X aCSF sans magnésium ou le calcium. Réactifs énumérés dans millimolaire. Numéros de catalogue se réfèrent à Sigma / Aldrich.
| 2 Litres 10X ACSF (sans Mg ou Ca) | |||
| Réactifs | mM | g/2L | Catalogue |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Le glucose | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Ajouter de l'eau distillée à 2L | |||
Nous allons également préparer des solutions 1M de MgSO 4 et CaCl 2 dans 50 ml d'eau pour permettre des ajustements en molarité d'une expérience à et pour assurer le calcium demeure en solution.
| Le calcium et les stocks de magnésium 1M | |||
| Réactifs | M | g/50mL | Catalogue |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
La solution doit être aCSF gazés avec carbogène (95% O2 / 5% de CO2) pour abaisser le pH avant d'ajouter du calcium ou le calcium précipité.
| 1 Litre aCSF | |
| Réactifs | Volume |
| 10X aCSF | 100mL |
| 1M CaCl 2 | 1 ml (dissection) 2mL (enregistrement) |
| 1M MgSO 4 | 1 ml |
| Ajouter ~ 800 ml d'eau distillée, de gaz avec carbogène pendant 2 minutes avant d'ajouter du calcium | |
| Ajouter de l'eau distillée à 1L. | |
Les pompes et les tubes et plats dissection doit être rincée avant et après utilisation.
Dissection
Alors que la dissection, 1 mM de calcium aCSF devrait être continuellement gazés avec carbogène. Le aCSF peut être siphonnée à partir d'une bouteille à l'antenne de dissection et pompée dans le plat à dissection pour la bouteille ou envoyés à des déchets. Nous utilisons un élastomère (Sylgard, Dow Corning) plat recouvert d'effectuer la dissection.
La souris néonatales est rapidement décapité avec des ciseaux pointus et une incision faite avec des ciseaux à travers le thorax et l'abdomen ventral. L'animal est ensuite éviscéré. La souris éviscéré est rincé avec aCSF. L'animal est ensuite épinglé à disséquer le plat avec des épingles insectes inséré par les membres antérieurs et à la base de la queue.
La colonne vertébrale est enlevé par l'exécution d'une laminectomie ventrale. La colonne vertébrale est tenue avec petits forceps et une lame de petits ciseaux est insérée immédiatement à l'arrière de la colonne vertébrale osseuse. Le limbe est coupé sur un côté puis de l'autre tout en soulevant doucement la colonne vertébrale osseuse. Ceci est effectué pour la longueur de la colonne vertébrale.
La moelle épinière est enlevée par une coupe le long de chaque côté de la moelle épinière de couper les racines du nerf rachidien et couper les méninges entourant la moelle épinière. Nous avons coupé sur les côtés droit et gauche, puis on coupe les méninges attaché à la face dorsale de la moelle épinière pour le libérer. Le cordon isolé est ensuite épinglé à plat près de l'entrée aCSF pour assurer une bonne oxygénation, si d'autres animaux sont disséqués.
Le cordon médullaire isolée est ensuite transféré dans une boîte d'enregistrement à l'aide d'une petite cuillère ou une spatule. Ici, nous perfuser la préparation avec du calcium oxygéné 2mM aCSF. La moelle épinière est épinglée sur le plat enduit d'élastomère et micromanipulateurs utilisés pour déplacer extracellulaire, l'ensemble des électrodes d'aspiration profondes près des racines. Lorsque l'extrémité de l'électrode est proche de la fin de la racine libre, aspiration douce est appliquée pour attirer la racine dans l'électrode d'aspiration. Ce processus peut être répété pour enregistrer simultanément plusieurs racines.
Figure 1. Décapitation et éviscération. A. Rapidement décapiter la souris avec des ciseaux pointus. Contributions plus ou moins grande du tronc cérébral peut être réalisé selon le niveau de coupe. B. Lieu une lame des ciseaux dans l'ouverture de la cavité thoracique créé par la décapitation. Ouvrez le thorax et l'abdomen ventrale à la base de la queue. Retirer les viscères et les rincer à l'aCSF.
Figure 2. Suppression de la colonne vertébrale. A. Insérez la lame gauche de la paire de ciseaux dans l'espace entre la colonne vertébrale et la moelle épinière à la droite de la moelle épinière et couper à travers les os pose ventrale de la moelle. Ensuite, insérez la lame droite de la paire de ciseaux dans l'espace entre la colonne vertébrale et la moelle épinière à la gauche de la moelle épinière et la coupe. B. Répétez ce processus tout en appliquant une légère traction sur la colonne vertébrale. Prenez soin de ne pas percer la moelle épinière en tenant les ciseaux à un angle faible.
Figure 3. Enlèvement de la moelle épinière. A. Insérez la lame gauche de la paire de ciseaux dans l'espace entre la moelle épinière et les os à la droite de la moelle épinière et couper à travers les racines épinière et les méninges pose latérale de la moelle. Ensuite, insérez la lame droite de la paire de ciseaux dans l'espace entre la moelle épinière et les os à la gauche de la moelle épinière et couper à travers les racines épinière et les méninges pose latérale de la moelle. B. Enfin, soulevez doucement le cordon rostrale et couper les méninges de brancher le cordon dorsal pour les lames. Encore une fois prendre soin de ne pas percer la moelle épinière en tenant les ciseaux à un angle faible. Ne pas couper les racines trop proches de la moelle épinière.
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Discussion
Le cordon isolées néonatale épinière fournit une méthode souple d'étudier développement1 système nerveux, 2. Au sein de la moelle épinière lombaire des rongeurs nouveau-nés, au centre de circuits générant modèle peut produire la locomotion fictive, en présence de neurotransmetteurs. Cette locomotion fictive consiste à augmenter l'activité rythmique, des éclats, qui sont produites à 0,2 à 0,5 Hz. Ces éclats sont organisés pour produire une alternance gauche-droite le long de l'alternance du cordon et fléchisseurs extenseurs (ipsilatérale relatifs L2 à L5). Plusieurs mutations génétiques chez la souris ont été montré pour avoir un comportement anormal 3-5. Comprendre comment les circuits neuronaux de la moelle épinière est altérée au cours du développement et de perturbations génétiques informera des études des circuits neuronaux dans le reste du SNC.
Il est à noter qu'il existe plusieurs solutions standard aCSF en usage régulier. Voici un tableau des préparatifs aCSF couramment utilisés.
Tableau 1: Compositions commune aCSF
| Laboratoire | Composition aCSF en mM |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 de glucose. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3,08, 2,52 CaCl 2, MgSO 4 1,25, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 de glucose |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, KCl 1.9 à 3.9, 1.2 KH 2 PO 4, CaCl 2 2,4, 1,3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 de glucose |
| Ziskind-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, KCl 3, 1 CaCl 2, MgCl 2 6, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 de glucose |
| Ziskind-Conhaim extracellulaire (7) | 113 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 1, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 de glucose. |
| O'Donovan, poussin (8,9) | 139 NaCl, KCl 2,9 à 5, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 de glucose |
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Disclosures
SOINS DES ANIMAUX
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff est un professeur dans les laboratoires de l'expression génique au Salk Institute for Biological Studies et un chercheur à l'Institut médical Howard Hughes. Ce travail a été soutenu par la Christopher Reeve et Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent et Mike Sullivan Schnoeker de Ressources Multimédia à l'Institut Salk a fourni une aide à la photographie et l'édition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
