Summary
Метод выделения специфические типы клеток из растительного сырья демонстрируется. Эта техника работает трансгенных линий маркера выражения флуоресцентных белков, в частности, типы клеток, клеточной диссоциации и флуоресценции Активированный сортировки клеток. Кроме того, рост установки устанавливается здесь, что облегчает лечение
Abstract
Высокое разрешение, типа клеток конкретных анализ экспрессии генов значительно усиливает понимание развития, регулирования и ответов на стимулы окружающей среды в любой многоклеточного организма. В гибридизация и визуализации репортер ген может в ограниченной степени использоваться для этой цели, но для высокого разрешения количественных RT-PCR или высокой пропускной транскриптома всей анализ изоляции РНК из отдельных типов клеток является необходимой. Сотовая диссоциация ткани выражения флуоресцентного маркера белка в определенный тип клеток и последующее флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) позволяет собрать достаточное количество материала для выделения РНК, кДНК анализа синтеза / усиления и микрочипов.
Обширный набор типа клеток конкретных флуоресцентных линий репортер доступна для научного сообщества растений. В этом случае два маркера линий Arabidopsis thaliana корень используются: P SCR:: GFP (эндодермы и покоя в центре) и P WOX5:: GFP (в состоянии покоя в центре). Большое количество (тысячи) рассаду выращивают гидропоники или на чашках с агаром и собирается получить достаточно материала, корневой для дальнейшего анализа. Сотовая диссоциации растительного материала достигается за счет ферментативного переваривания клеточной стенки. Эта процедура пользуется высокой осмолярности вызванных плазмолиза и коммерчески доступных целлюлазы, пектиназы и hemicellulases выпустить протопластов в раствор.
СУИМ из GFP-положительных клеток использует визуализации зеленых против красного спектра излучения протопластов возбуждаются 488 нм лазер. GFP-положительных протопластов можно отличить по их повышенной отношение зеленого до красного излучения. Протопластов, как правило, сортируется непосредственно в буфере добычи РНК и хранить для дальнейшей обработки на более позднее время.
Этот метод показан, чтобы быть простым и эффективным. Кроме того, показано, что она может быть использована без труда выделить достаточное количество клеток для транскриптом анализа, даже при очень скудных типов клеток (например, покоящихся клеток в центре). Наконец, рост установка для Arabidopsis саженцев Показано, что дает возможность лечения неосложненной растений до сортировки клеток (например, для типа клеток конкретного анализа биотических или абиотических ответы стресса). Потенциальные дополнительные использует для FACS растительных протопластов обсуждаются.
Protocol
1) Подготовка растительного материала
- Протопласты могут быть получены из различных видов растений и тканей при условии, что правильное сочетание клеточной стенкой ферментов используется 1. Перед натурного эксперимента проводится, мелкие переваривания материала желательно, чтобы оценить эффективность protoplasting ткани, ферменты и т.д. и оценить процент позитивных клеток для сортировки клеток. Здесь протопластов производные от корней Arabidopsis thaliana, что саженцы типа клеток-специально выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) используется. Эндодермы и покоя центра отмечены P SCR:: GFP и покоя центра P WOX5:: GFP 2,3 (рис. 1).
- Рассаду выращивают в гидропонике phytatrays (Sigma; рис. 2а) на нейлоновый фильтр (250 мкм сетки; NITEX), которая позволяет через корни растут в среду роста (0,22% вес / Мурасиге и Скуга базальной среды [Sigma], 1% м / о сахарозы, 0,05% вес / МЧС [2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты], рН 5,7 с КОН). Кроме того, растения могут быть выращены на вершине нейлоновый фильтр (100 мкм сетки) в вертикальном положении 1% агар пластин (рис. 2б).
- Использование вышеуказанных фильтров не только помогает в сборе урожая корней, она также облегчает дополнительная обработка саженцев, если это необходимо. Фильтры позволяют саженцы должны быть переданы в массовом порядке новые phytatrays или агаром дополнен катализатором интереса. Например, phytatray создана была использована для типа клеток конкретного анализа транскрипционный ответ на азот лечение в Arabidopsis саженцы 4.
- Убедитесь, что ваш микроскопически флуоресцентного маркера правильно выражены (особенно при использовании варианта лечения, так как тип клеток-специфических маркеров сами могут находиться под влиянием лечения). В этом случае, саженцы проверяются под флуоресцентным микроскопом (Nikon, рисунок 1). Обратите внимание, что тип клеток конкретных флуоресцентных линий маркера должны характеризоваться первоначально под конфокальной микроскопии, чтобы определить, какие именно типы клеток, помечены и определить различия в выражении.
2) Подготовка protoplasting решение
- Растворить 1,25% вес / Целлюлаза (Yakult), 0,3% мас. / Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-маннита, 20 мМ MES и 20 мМ KCl (от 1 акции M) в деминерализованной воде и отрегулировать рН до 5,7 1 М Трис / HCl рН 7,5. Это решение будет немного мутным.
- Тепло решение до 55 ° С в течение 10 минут (решение станет ясно) и дайте ему остыть до комнатной температуры перед добавлением 0,1% м / о BSA (бычий сывороточный альбумин), 10 мМ CaCl 2, и 5 мМ β-меркаптоэтанол .
3) Сбор и protoplasting из растительного сырья
- Корни собирают путем соскабливания их с нейлоновой сетки с помощью скальпеля и сданы на хранение в колбу protoplasting решение. Как правило, 10 мл protoplasting решение использовано в 1500 корней рассады.
- Встряхнуть колбы осторожно (75 мин) при комнатной температуре в течение одного часа. Больше инкубационный период может увеличиться протопластов урожай, но также добавит к действию protoplasting себя на экспрессию генов.
- Фильтры протопластов решение с 40 мкм ячейки фильтра (BD Falcon) и разделить раствор на конических труб 15 мл (BD Falcon).
- Спиновые труб в свинг-ведро центрифуге в течение 10 минут при 500 Обратите внимание, что это Г. центрифугирования скорость будет зависеть от типа протопластов использовали, их хрупкость и количество клеточного мусора, образующихся при ферментной обработки.
- Удалите большинство супернатант, ресуспендируют протопластов в оставшийся раствор и проверять их микроскопически (рис. 3).
- Воспользуйтесь hemacytometer оценить количество и плотность протопластов. Плотность клеток будет определять образцы скорость впрыска, событий в секунду и, следовательно, общее время, необходимое для сортировки клеток FACS (см. также раздел 4.3).
- 3.7) Либо перейти непосредственно к FACS или мыть и ресуспендируйте протопластов в инкубационный раствор, таких как W5 (154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 5 мМ MES, отрегулировать рН до 5,7 с КОН) или protoplasting решение без добавил ферментов. Особенно при взгляде на транскрипционные изменения, она имеет важное значение для минимизации воздействия на образцы, условия, которые могли бы повлиять на экспрессию генов, таких как изменение буфера протопластов хранятся дюйма Поэтому рекомендуется держать протопластов в protoplasting решение и приступить для FACS как можно скорее.
4) Флуоресценция Активированный сортировки клеток протопластов
- Включение и подготовить ячейки сортировщика. Здесь FACSAria (BD) не используется.
- Настройка потока потока с 100-мщ м сопла и 20 фунтов на квадратный дюйм оболочки давления.
- Клеточной плотности и скорости образец инъекций может быть настроен на конкретный эксперимент исходя из того, наилучшим выходом или быстро достижимые скорости лучшего. Мы успешно отсортированы с плотностью до 10 млн клеток / мл.
- С помощью опции образец агитации на FACS для предотвращения оседания протопластов. Если засорение FACS является вопрос, Есть три возможные действия для устранения неполадок: 1. Выполните образец строки обратной промывки. 2. Развести ваш протопластов подвеску для уменьшения плотности. 3. Очистка протопластов решение, повторяя шаг фильтрации (3,3) после центрифугирования и ресуспендирования.
- Подготовка аппарата для измерения рассеяния вперед (FSC), боковые рассеяния (SSC) и излучения на 530/30 нм для GFP и 610/20 нм для красного спектра флуоресценции (RSA) после возбуждения 488 нм лазер. Эти, по сути, только параметры, используемые для изоляции GFP-положительных протопластов. Здесь, напряжение настройки были следующими: FSC - 60V, SSC 250В, 350В GFP и RSA 335V. Обратите внимание, что оптимальные настройки напряжение будет различным для каждого FACS и даже должны быть скорректированы в течение всей жизни клетка сортировщика.
- Начните с создания dotplot для рассеяния вперед по сравнению стороне разброс. Применить настройки напряжения, чтобы измерять события сосредоточены в заговоре.
- Затем создайте точку участок зеленых против красной флуоресценции сигналов. Применить настройки напряжения, так что измеряется событиями выход в центре диагональ населения в сюжете, глядя на дикого типа (не-GFP) протопластов подвески. Протопластов подвески происходит от линии маркера GFP будет производить ясно населения зеленого флуоресцентного события никогда не видели в дикого типа образцов.
- Установить компенсацию ограничений для корректировки спектрального перекрытия между GFP и RSA. Правильное настройки ограничения компенсации позволит улучшить разделение GFP-положительных протопластов из не-GFP протопластов и мусора. Ограничений используется здесь в следующем: RSA, минус 17,91% GFP.
- Настройка ворота для выявления GFP-положительных событий, отрицательного контроля не-GFP протопластов должна быть использована для помощи в определении ворота границ (рис. 4).
- Реализация вперед отсечки разбросом, чтобы оставить небольшой мусор из анализа. Визуализируйте GFP-положительных событий в сюжете ФСБ против SSC, чтобы помочь определить размещение отсечки. Здесь, отсечка была установлена на уровне 5.000. Обратите внимание, что СУИМ будет считать мусором как своего рода события и образцов с высоким уровнем мусора может иметь различную процентов GFP положительных событий, чем ожидалось. Это не обязательно проблема. Однако, чем больше мусора в образце, тем дольше рода займет.
- В зависимости от опыта и обилие тип клеток, которые будут проанализированы, установить режим FACS точности как для оптимального выхода или оптимальная чистота отсортированных клеток.
- Для экстракции РНК, подготовить коллекцию труб (1,5 мл микроцентрифужную трубы) с соответствующим количеством буфера добычи РНК. С этой установкой, 20000 сортировки событий даст общий объем около 100 мкл, которые были отсортированы в до 350 мкл буфера для экстракции (RNeasy микро-комплект, QIAGEN). Смешайте образцов после завершения сортировки в качестве клеточной суспензии могут объединить в верхней части.
- Магазин образцов или перейти непосредственно к РНК добычи. Успешный анализ микрочипов были предварительно с РНК, выделенная из всего 500 отсортированных событий. Здесь мы использовали RNeasy микро комплект добычи (QIAGEN), WT-Ovation Пико РНК Усиление системы и FL-Ovation кДНК Биотин модуля V2 (NuGEN).
Представитель Результаты
Один phytatray около 1500 один-недельных P SCR:: GFP рассады дали около 60.000 протопластов (по данным hemacytometer). 2,6% от 65000 FACS-обрабатываемых событий были определены как GFP-положительных и были отсортированы (рис. 4б).
Восемь пластин около 1500 четырехдневной давности P WOX5:: GFP рассаду каждый (12 000 общего числа) дали около 30 миллионов протопластов (по данным hemacytometer). 0,063% от 16 миллионов FACS-обрабатываемых событий были определены как GFP-положительных и были отсортированы (рис. 4в).
10000 сортируются события обычно используются для добычи РНК и может дать от 20 до 140 нг тотальной РНК (рис. 5).
Рисунок 1. Сотовые зависимости от конкретного типа GFP маркером линии Arabidopsis корни. Флуоресцентные изображения микроскопа были сделаны с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) и GFP фильтр на микроскоп Eclipse 90i (Nikon), работающих на Метаморф программное обеспечение (Molecular Devices). DIC и GFP изображений были наложены для визуализации целей. Два маркера линий, используемых в этом визуального эксперимента представлены;а) Р SCR:: GFP и б) Р WOX5:: GFP.
Рисунок 2. Рост растений условиях. Рассаду выращивают в экологические контроллер гидропонике в phytatrays () или на вертикально агаром (б).
Рисунок 3. Завод протопластов выражения GFP. Флуоресцентные изображения микроскопа были сделаны с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) и GFP фильтр на микроскоп Eclipse 90i (Nikon), работающих на Метаморф программное обеспечение (Molecular Devices). DIC и GFP изображений были наложены для визуализации целей. Стрелки показывают взрыв ячейки и мусора и GFP-положительных протопластов. Расстояние между двумя белыми линиями составляет 50 мкм.
Рисунок 4. Флуоресценции активирован сортировки клеток из GFP-положительных протопластов протопластов основе дикого типа () P SCR.:: GFP (б) или P WOX5:: GFP (с) маркером линии были проанализированы и сортируются с FACSAria (BD), используя ворота определены на dotplot зеленого (530/30 нм; ось х) по сравнению с красным (610/20 нм, у оси) флуоресценции. 100000 событий представлены в каждом сюжете. События, входящим в ворота сортировки GFP выделены зеленым цветом.
Рисунок 5. Представитель РНК выписки из 10,000 отсортированных клеток. Клетки были отсортированы непосредственно в РНК буфера для экстракции (QIAGEN), РНК очищали и проверяется на концентрации, чистоте и целостности на 2100 Bioanalyzer (Agilent). Три повторяет как для маркера строк показываются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протопласты могут, в принципе, быть получены из различных растительных тканей, оптимизации благоприятных условий значительно повысит РНК качество и количество. Оба protoplasting решения и выборные буфера инкубации использоваться будет влиять на этот аспект.
Много разных флуоресцентных белков могут быть использованы, в зависимости от возможностей FACS использоваться, например, GFP, ППП, YFP, CFP или их много вариантов и производных. Выражение маркеров может определяться не только тип клеток конкретных промоутеров или усилитель ловушки, как показано здесь, но и ваш любимый промоутер, например, гормон реагирует синтетический ген репортер 5. Двойной FACS цвет протопластов растений также возможно. Это может, например, применяться при выполнении анализа переходных преобразования, используя вектор с флуоресцентным маркером положительного выбора 5.
Протопласты также можно сортировать для анализа геномной ДНК, белков или метаболиты 6. Хранение протопластов жив после сортировки является сложной задачей из-за их хрупкой природы, с использованием больших (130 мкм), сопло и нижней оболочки давления и сортировка их в буфер оптимизированы инкубации повысят после сортировки протопластов жизнеспособность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда (грант №. DBI 0519984) и Национального института здоровья (грант №. 5R01GM078279) ..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
