Summary
Questo protocollo descrive la produzione di KLRG1 tetramero, che è un potente strumento per l'analisi di KLRG1 ligandi.
Abstract
Cellule killer lectina come G1 recettore (KLRG1) è un tipo di recettore della glicoproteina transmembrana II inibitorio appartenenti al tipo C-lectina come superfamiglia. KLRG1 esiste sia come monomero e come disolfuro-linked omodimero. Questo ben conservato si trova recettore sulle cellule più mature e recentemente attivato NK e su un sottogruppo di cellule T effettrici / memoria.
Utilizzando KLRG1 tetramero così come altri metodi, E-, N-, e R-caderine sono stati identificati come KLRG1 leganti. Questi Ca +-dipendente cellula-cellula molecole di adesione si compone di un dominio extracellulare contenente cinque ripete caderina responsabile interazioni cellula-cellula, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico che è legato al citoscheletro di actina 2.
Generazione del tetramero KLRG1 era essenziale per l'identificazione dei KLRG1 ligandi. KLRG1 tetramero è anche uno strumento unico per chiarire la caderina ruoli e giocare KLRG1 nella regolazione della risposta immunitaria e l'integrità dei tessuti.
Protocol
Preparazione dei corpi inclusi
- Inoculare 4 x 500 ml di fiaschi TB ciascuno contenente 50 mg / ml di cloramfenicolo carbenicillina e con una cultura durante la notte di batteri che esprime la KLRG1 costruire plasmide. Quando il diametro esterno raggiunge 0,6 A a 600 nm, indurre con l'aggiunta di 0,4 M IPTG e incubare la cultura per ulteriori 4 ore in agitazione a 37 ° C.
- Risospendere le cellule raccolte in pH tampone risospensione = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (p / v) di saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellet possono essere congelati in questa fase.
- Piscina non più di 60 ml di resuspensions batterica in un bicchiere polipropilene. Se necessario regolare a 60 ml con tampone TE pH 8,0 e mescolate miscela a velocità dimezzata.
- Per mescolando miscela aggiungere goccia a goccia: lisozima (finale = 1 mg / ml), MgCl2 (finale = 5 mm), 2 mg DNAsi I nel 50% glicerolo contenute 75 mm NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), DTT ( finale = 10 mm).
- Sonicare la soluzione in ghiaccio per 1,5 minuti e centrifugare il lisato a 5.000 giri per 10 minuti a 4 ° C.
- Decantare il surnatante.
- Aggiungere 15 ml di tampone di lavaggio pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Sul ghiaccio, ultrasuoni soluzione per 1,5 minuti fino a quando il pellet è completamente risospeso.
- Centrifugare i campioni a 5.000 giri per 10 minuti a 4 ° C.
- Ripetere il lavaggio 5 volte.
- Ripetere 5b con tampone di lavaggio senza Triton X-100, centrifuga e risospendere in 4 ml di tampone TE.
- Prendere sul bagnato inclusione peso enti liquami e conservare in TE buffer alla concentrazione di 30 a 100 mg / ml.
Ripiegamento di KLRG1
- Fare 1 l di ripiegamento tampone pH = 8.0 (0.4 M-Arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mm PMSF, 3 EDTA senza compresse inibitore della proteasi, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) e freddo a 4 ° C sotto agitazione.
- Preparare i corpi di inclusione per l'iniezione nella miscela pieghevole: è l'ideale per fare 5 10 iniezioni ciascuna con 0,25 0,5 concentrazione mM in modo che la concentrazione finale della proteina saranno 2 3 micron.
- Fate sciogliere il volume di 50 mg di liquami inclusione corpi in 7 M GnHCl con 10 mM β-mercaptoetanolo.
- Mantenere l'inserimento corpi / miscela GnHCl a 37 ° C per 30 - 40 min e vortice ogni 5 minuti per assicurare fusione completa (liquame diventerà chiaro quando completamente sciolto).
- Centrifugare alla massima velocità per 30 min in microcentrifuga a 4 ° C e trasferire il sopranatante in una provetta da centrifuga da 15 ml. Non a trasferire dei piccoli pellet nerastro.
- Regolare il volume con tampone di iniezione (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Iniettare 1 ml di corpi inclusi diluito ogni ora. Quando si somministra, mescolate ad alta velocità, aggiungere 1 ml di goccia diluita corpi inclusi a goccia con 2 secondi tra ogni goccia. Quando l'iniezione viene fatta, mescolare a bassa velocità.
- Continuare a mescolare durante la notte a bassa velocità a 4 ° C.
Concentrazione delle reazioni ripiegamento
- A seguito di protocollo Millipore s, concentrare l'1 L di pre-filtrati (0,22 micron filtrata) reazione ripiegamento utilizzando un Amicon mescolato cellulare e YM10 NMWL ultrafiltrazione 10K membrana (Millipore) a ~ 10 ml.
- Concentrato a ≤ 2 ml con un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Purificazione di KLRG1 tetramero
- Impostare il AKTAFPLC a 4 ° C secondo GE Healthcare manuali.
- Purificare la forma di monomero KLRG1 per cromatografia dimensione esclusione utilizzando un Sephacryl S-200 ad alta risoluzione 16/60 colonna (GE Healthcare) in 20 HEPES mm e 150 mm NaCl. (Vedi figura 1).
- Concentrato a 1 ml con Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Usa enzima Bira secondo il protocollo Avidità s per biotinylate il monomero KLRG1.
- La biotina libera viene eliminato mediante cromatografia dimensione esclusione come in 2.
- KLRG1 molecola è tetramerized mescolando KLRG1 monomero con 4 volte molare in eccesso PE coniugato streptavidina (BD Biosciences).
Rappresentante Risultati
Figura 1. Rappresentante risultati positivi dal cromatografia dimensione esclusione Akta FPLC del ripiegate KLRG1. Il grafico mostra la separazione del monomero (83,52 ml), dimero (56,36 ml), e multimer (36,26 ml) forma del ripiegate KLRG1. Il picco a 94,25 ml rappresenta lo scambio di buffer.
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Discussion
In questo protocollo, viene mostrato come purificare, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramero può essere utilizzato per etichettare KLRG1 ligandi mediante citometria di flusso. Sebbene le condizioni ripiegamento dovranno essere testati empiricamente per ogni proteina, altro tipo C lectine potrebbe essere tetramerized utilizzando un protocollo simile. Utilizzando proteine tetramerized come sonde, ligandi di orfano di tipo C recettori lectina potrebbero essere identificati.
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Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Naidenko per aiutare ad ottimizzare le condizioni di ripiegamento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH assegno di ricerca AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh è sostenuto da NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuiscono ugualmente a questo lavoro.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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