Summary
本协议描述了识别和解剖成年斑马鱼的器官的过程。
Abstract
在过去的20年中，斑马鱼已成为一个强大的模式生物，为了解脊椎动物的发育和疾病。虽然是广泛的胚胎和幼虫的实验分析和形态一直都有详细记载，成年斑马鱼的解剖和发展成人的结构和器官的研究说明，连同与成人工作的技术，所缺乏的。幼虫机关接受在其整体结构，形态，解剖位置，并在向成年过渡的幼虫的重大变化。从外部看，透明的幼虫发展其特点成人条纹色素模式和配对腹鳍，而在内部，机关经过大量增长和重塑。此外，bipotential性腺原基发展成为无论是睾丸或卵巢。该协议确定成人的许多器官和演示脑，性腺，肠胃系统，心脏，和成年斑马鱼的肾脏解剖的方法。可用于原位杂交，分子生物学技术，组织学，免疫组织化学法提取RNA，蛋白质分析，和其他解剖器官。该协议将有助于在斑马鱼在扩大研究范围，包括幼虫器官的重塑，成人器官系统的成年和其他调查机关的具体形态发生。
Protocol
- 将一只雄性斑马鱼解剖第一，其次是雌鱼。开始剥离之前，麻醉在0.2％Tricaine的鱼，然后安乐死在冰水中的潜伏期为15分钟。
- 首先，轻轻拍着干纸巾上的鱼放在解剖垫。对外，斑马鱼有单一的背鳍，尾鳍和臀鳍和成对的胸鳍和腹鳍（图1）。
图1。成人男性标有鳍鱼类。 - 引脚通过解剖垫鱼尾巴的肉质部分和眼圈腹侧部分。
- 剪断腹鱼的臀鳍前的皮肤。剪切沿着腹部的皮肤和下面的肌肉从臀鳍到鳃盖（硬覆盖在鳃）（图2，第1步）。
图2，在去除皮肤和体壁肌肉暴露内部器官的步骤。 - 接下来，删除的鳃盖和胸鳍，包括肩带（厚，鳍基骨的区域）（图2，第2步）。切沿一侧的鱼，从现在暴露的鳃后部皮肤及以上潜在的肌肉开始又回落到臀鳍（图2，第3步）。
- 小心取出从一侧的鱼的皮肤和下面的肌肉。现在许多内部器官可见（图3）。
图3。成年雄鱼体壁肌肉除去，使机关内部的可视化。 - 睾丸长，白色，配对，连接到背体壁机关。取出睾丸和地方菜的PBS。反射光检查睾丸曲细精管（图4），其中包含各个阶段发展spermatagonia到精子的生殖细胞囊肿（莱亚尔等，2009）可视化。
图4。睾丸解剖。白色圆形的结构，曲细精管。 - 下一步，清除肠胃系统从鱼的体腔。规模大，叶状形态，tannish颜色，和广泛的血管，肝脏，可确定。胆囊，一个绿色的半透明的充满液体的囊，脾，出现鲜红色，内脏内被发现。
- 从其他机关单独小肠和伸展出来。高度上皮褶皱（Wallace等人，2005年）的前，中，后肠道内的地区被定义。
- 将一块在PBS肠道和使用透射光观察上皮褶皱。
- 接下来，检查的鱼鳔。鳔后房型通过气动管，和前房通过韦伯器具（芬尼等人，2006年），它是连接到内耳，它是连接到食道。
- 删除和丢弃的鱼鳔。不固定的鱼，并重新针它的腹侧方解剖肾，这是位于沿背侧体壁。肾脏是一种半透明的粉红色的结构与背主动脉和色素细胞相关。肾脏分为头部，身体和尾部区域（图5）。解剖出一块肾脏和地方的PBS。梳理除了肾组织透露肾小管。
图5。头部，身体和尾部沿肾脏背侧体壁的位置。 - 解剖雌鱼。如前所述，安乐死在冰水中的鱼和寄托解剖垫之前，帕特干燥。正如先前所表现出的鱼从一侧取出皮肤。卵巢是一个bilobed结构，悬浮体腔血管卵巢系膜。
- 取出卵巢叶，在PBS的地方，并与透射光检查。卵母细胞可以被戏弄除了使用细针，然后上演（图6中，塞尔曼等，1993年）。舞台上我的卵母细胞大约有10 - 150微米的大小和半透明。第二阶段的卵母细胞约150 - 350微米大小和皮质颗粒的外观定义。第三阶段卵母细胞有350 - 750微米大小，由于卵黄的积累，是不透明的。成熟阶段IV和V的卵母细胞是半透明的，一般不会在最近交配的女性卵巢中发现。
图6现场舞台下观察我，二，三卵母细胞。解剖显微镜透射光。 - 接下来，解剖鱼的心脏。心脏位于鳃后，腹。首先切出心脏和周围组织，并把它在PBS。仔细剖析了心脏周围的组织，小心不要损伤娇嫩的心房。
- 将解剖林格氏液，观察心脏跳动的心脏。
确定的心房，心室和bulbus动脉（图7，胡锦涛等，2001）。
图7。解剖成人心脏。 - 完成去除鱼的大脑解剖。 unpinning鱼，用刀片去除头部开始。尽可能从取出的头骨与腹侧方钳尽可能多的软组织。取出的眼睛，用小弹簧剪刀。破开的头骨和消除大脑的腹侧骨。现在放置在头菜的PBS和消除大脑背侧皮肤和头骨。
- 确定的嗅球，端脑，缰，视神经顶盖，小脑和延髓（图8，Wullimann等，1996;席林，2002）。
图8。成年斑马鱼的大脑解剖。背视图，前顶。
Disclosures
动物实验是由宾夕法尼亚机构动物护理和使用委员会大学规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予R01 HD050901 MCM和美国癌症协会博士后奖学金＃PF - 05 - 041 - 01 - DDC到TG的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0 |
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| Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O |
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| Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2 |
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| Dissecting dish with mat | Electron Microscopy Sciences | 70540 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
References
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
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