Summary
माउस में ट्रांसवर्स महाधमनी कसना (टीएसी) आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मॉडल कार्डियक hypertrophy और दिल की विफलता के विकास के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन है. यहाँ, हम प्रक्रियाओं महाधमनी चूहों में कार्डियक hypertrophy की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डिग्री बनाने कसना वर्णन करने के लिए.
Abstract
माउस में ट्रांसवर्स महाधमनी कसना (टीएसी) अधिभार प्रेरित कार्डियक hypertrophy और दिल की विफलता के दबाव के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मॉडल है.
Protocol
भाग 1: ऑपरेटिंग फील्ड तैयार
- ऑपरेटिंग क्षेत्र 75% isopropyl शराब के साथ कीटाणुरहित है.
- सुनिश्चित करें कि हीटिंग पैड पर और सही तापमान पर है. एक सिफारिश प्रणाली Gaymar परिसंचारी पानी पंप एक चिकित्सा पैड है कि 37 में बनाए रखा है डिग्री सेल्सियस ± 1 ° सी. से जुड़ा है यह सर्जरी के दौरान सामान्य शरीर का तापमान बनाए रखने के रूप में दिल की दर में तेजी से कमी से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
- सर्जिकल उपकरण सर्जरी से पहले एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में निष्फल रहे हैं. कुंद कैंची, बेशक घुमावदार संदंश 2 एक्स, ठीक 45 ° angled संदंश 2 एक्स, angled वसंत कैंची, सीने में retractor, और सुई धारक: इस प्रक्रिया के लिए, आप निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों की आवश्यकता होगी
- कपास applicators रक्तस्राव के मामले में हाथ पर होना चाहिए.
भाग 2: तैयार करना और चूहे की इंटुबैषेण
- चूहे एक प्रेरण कक्ष में anesthetized हैं के साथ 2% isoflurane 0.5 एल / 100% 2 हे मिनट -1.0 के साथ मिश्रित .
- बालों कतरनी neckline से मध्य सीने स्तर पर फर दाढ़ी के लिए उपयोग किया जाता है.
- माउस एक हीटिंग पैड के ऊपर एक लापरवाह स्थिति में रखा जाता है क्रम में शरीर का तापमान बनाए रखने के.
- एक रबर बैंड पशु सामने दाँत पर रखा गया है गर्दन का विस्तार करने के लिए. एक हाथ में घुमावदार संदंश का प्रयोग, जीभ धीरे पक्ष के लिए चालाकी है. दूसरे हाथ के साथ, अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण पीई 90 टयूबिंग का उपयोग किया जाता है. अंतःश्वासनलीय ट्यूब तो 125-150 साँस / मिनट पर एक हार्वर्ड मात्रा साइकिल कृंतक वेंटीलेटर साइकिल चालन और 0.1-0.3ml के एक ज्वार की मात्रा से जुड़ा है. 1.0 एल / मिनट 100% 2 हे - शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, संज्ञाहरण में 1.5-2% 0.5 के साथ isoflurane बनाए रखा है . संज्ञाहरण के सही स्तर माउस नाखून बिस्तर (पैर की अंगुली - चुटकी पलटा) पर दबाव लागू करने के द्वारा सत्यापित है.
- शल्य चिकित्सा क्षेत्र betadine समाधान के साथ 70% शराब के बाद कीटाणुरहित है. यह प्रक्रिया तीन बार दोहराया है.
- आपरेशन के दौरान शल्य चिकित्सा क्षेत्र के प्रदूषण को रोकने के लिए, एक बाँझ टांगना माउस छोड़ने पर रखा गया है केवल ऑपरेशन क्षेत्र उजागर.
- बाँझ दस्ताने का एक सेट प्रत्येक व्यक्ति माउस के लिए प्रयोग किया जाता है.
भाग 3: ट्रांसवर्स महाधमनी के Ligation
- दूसरा रिब करने के लिए आंशिक thoracotomy एक शल्य खुर्दबीन के तहत किया जाता है और उरोस्थि सीने retractor का उपयोग कर मुकर गया.
- ठीक 45 टिप ° angled संदंश धीरे महाधमनी चाप से thymus और वसा ऊतकों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है.
- अनुप्रस्थ महाधमनी की पहचान के बाद, एक 6.0 रेशम सीवन के एक छोटा सा टुकड़ा अनामी और बाएँ मन्या धमनियों (चित्रा 1) के बीच रखा गया है.
- दो ढीला समुद्री मील अनुप्रस्थ महाधमनी के आसपास बंधे हैं और 27 की एक छोटा सा टुकड़ा साढ़े गेज कुंद सुई समानांतर अनुप्रस्थ महाधमनी के लिए रखा गया है. पहली गाँठ जल्दी से सुई के खिलाफ बंधा हुआ है, दूसरे के द्वारा पीछा किया और सुई तुरंत क्रम में व्यास 0.4mm के एक कसना उपज हटाया. नकली नियंत्रण चूहों में, पूरी प्रक्रिया के महाधमनी के ligation के लिए छोड़कर समान है.
- सीने retractor निकाल दिया है और फेफड़ों फिर फुलाना 2 सेकंड के लिए वेंटीलेटर pinched बंद का बहिर्वाह.
- रिब पिंजरे के एक बाधित सीवन पैटर्न के साथ एक 6.0 prolene सीवन का उपयोग करने के लिए बंद कर दिया है.
- त्वचा एक सतत सीवन पैटर्न के साथ एक 6.0 prolene सीवन का उपयोग करने के लिए बंद कर दिया है.
भाग 4: पोस्ट ऑपरेटिव रिकवरी
- पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए, माउस buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) intraperitoneally के साथ अंतःक्षिप्त है. अगर वहाँ सर्जरी के बाद निर्जलीकरण के लक्षण हैं, बाँझ खारा intraperitoneally दिया है.
- संज्ञाहरण धीरे - धीरे बंद की स्थिति के लिए कम है और अंतःश्वासनलीय ट्यूब हटा जब सहज साँस लेने के संकेत होते हैं.
- माउस प्रवण की स्थिति के लिए ले जाया जाता है और एक हीटिंग पैड पर ठीक करने की अनुमति दी.
भाग 5: ट्रांसवर्स महाधमनी के सफल Ligation की पुष्टि
- टीएसी के बाद एक हफ्ते, फिर से दबाव अधिभार की डिग्री अनुप्रस्थ महाधमनी के ligation के द्वारा प्रेरित निर्धारित anesthetized माउस है. 1.0 एल / मिनट 100% 2 हे और शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस ± 1 ° सी. पर बनाए रखा - जैसा कि ऊपर वर्णित है, संज्ञाहरण में 1.5-2% 0.5 के साथ isoflurane बनाए रखा है
- एक 20 मेगाहर्टज डॉपलर जांच गर्दन के बाएँ और दाएँ पक्ष पर एक 45 ° कोण पर रखा गया है प्रवाह वेग का पता लगाने. एक कंप्यूटर आधारित डॉपलर सिग्नल प्रोसेसर (सिंधु उपकरण, ह्यूस्टन, TX) प्रदर्शित करने के लिए और डॉपलर संकेतों की दुकान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था 5.
- दबाव प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक अधिभार की डिग्री पर निर्भर करता है, एक सही मन्या (आर सी) / छोड़ दिया मन्या (नियंत्रण रेखा) एक निश्चित सीमा के भीतर प्रवाह अनुपात के साथ ही चूहों को आगे के विश्लेषण के लिए शामिल हैं. उदाहरण के लिए, दबाव अधिभार के एक उदारवादी डिग्री 5-8 की एक अनुपात करने के लिए होता है, जबकि एक तंग गंभीर दबाव अधिभार में जिसके परिणामस्वरूप कसना टी सुराग8-10 के oa अनुपात (5.3A चित्रा). एक नकली जानवर (ऑपरेशन लेकिन नहीं ligated), तथापि, 1 ~ (5.3B चित्रा) के अनुपात है की उम्मीद है.
6: प्रतिनिधि परिणाम
ठेठ शल्य जंगली प्रकार चूहों में टीएसी निम्नलिखित अस्तित्व के बारे में 80-90% है. अनुप्रस्थ महाधमनी के सफल शल्य चिकित्सा ligation सही है और छोड़ दिया मन्या धमनी के बीच एक डॉपलर प्रवाह वेग अनुपात (आर सी / नियंत्रण रेखा) (चित्रा 1) 5-10 के के लिए नेतृत्व करेंगे. दिखावा संचालित चूहों (2A चित्रा) की तुलना में दबाव अधिभार के साथ चूहों के लिए 1-2 सप्ताह है, और हृदय फैलने के भीतर 6-8 सप्ताह के बाद कार्डियक hypertrophy, विकास कसना (चित्रा 2B) की तंगी के आधार पर उम्मीद कर रहे हैं. टीएसी के बाद पहले महीने के दौरान मृत्यु दर जंगली प्रकार चूहों में आम तौर पर कम (<20%) है, हालांकि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को अलग जीवित रहने की दरों का प्रदर्शन कर सकते हैं 6,7.
चित्रा 1. ट्रांसवर्स महाधमनी डॉपलर वेग मापन का उपयोग Ligation की पुष्टि प्रतिनिधि डॉपलर अधिकार के वेग संकेतों (आर सी) और बाएँ मन्या धमनियों (नियंत्रण रेखा) 6 दिनों के बाद टीएसी. इन रिकॉर्डिंग आर सी / नियंत्रण रेखा 6.8 ~ के प्रवाह अनुपात के साथ एक सफल ligation प्रदर्शित करता है. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2. प्रतिनिधि टीएसी के बाद पूरे दिल छवियाँ. एक शाम संचालित जंगली प्रकार माउस दिल. बी. जंगली प्रकार माउस दिल 16 सप्ताह के बाद टीएसी. प्रत्येक पंक्ति = 1mm.
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Discussion
टीएसी, जो मानव महाधमनी प्रकार का रोग mimics एक आम विधि चूहों में कार्डियक hypertrophy और दिल की विफलता प्रेरित है. महाधमनी कसना के लिए वैकल्पिक साइटों आरोही और पेट महाधमनी शामिल हैं. आरोही महाधमनी कसना बाएं वेंट्रिकल (LV) पर एक चरम और अधिक तेजी से अधिभार प्रदान करता है. इसके विपरीत, उदर महाधमनी कसना बरकरार संभव मुआवजा के एक साधन के के रूप में संचलन का एक बड़ा भाग पत्ते 8 इसलिए, टीएसी अक्सर पसंदीदा मॉडल के रूप में यह एक समय पर निर्भर अधिक जांच करने के लिए उत्तरदायी तरीके में पर्याप्त एल.वी. अधिभार के लिए प्रदान करता है. हालांकि इस प्रक्रिया में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण अभ्यास के साथ किया जा सकता है, हम जंगली प्रकार चूहों में 80-90% की एक जीवित रहने की दर हासिल किया है.
अनुप्रस्थ महाधमनी कसना की जकड़न अतिवृद्धि विकास की डिग्री और समय सीमा है जिसमें हृदय की विफलता और फैलने विकसित के निर्धारित करता है. इसके अलावा, चूहों की उम्र वसूली दर और दिल की विफलता के विकास के कैनेटीक्स को प्रभावित करता है. बड़े चूहों (> 12 महीने की उम्र के) को अब लेने के टीएसी मन्या धमनियों के एक अनुकूली प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए, और फैली हुई cardiomyopathy के विकास की संभावना युवा चूहों (उम्र के 3-4 महीने) की तुलना में तेजी से कर रहे हैं 5.
चूहों के गैर इनवेसिव इंटुबैषेण कुछ अभ्यास लेता है. एक वैकल्पिक तरीका है के रूप में इस प्रकार है:
- एक छोटे midline ग्रीवा चीरा कुंद कैंची और घुमावदार संदंश का उपयोग करते हुए क्रम में ट्रेकिआ बेनकाब ट्रेकिआ के आसपास अलग ऊतक के साथ किया जाता है.
- सिवनी का एक टुकड़ा के सामने दांत के आसपास रखा गया है और धीरे से जानवर के शरीर से दूर खींच लिया गर्दन का विस्तार.
- एक हाथ में घुमावदार संदंश का प्रयोग, जीभ धीरे पक्ष के लिए चालाकी है.
- दूसरे हाथ के साथ, अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण प्रविष्टि के आराम के लिए किनारे पर पीई 90 beveled टयूबिंग का उपयोग किया जाता है.
अंतःश्वासनलीय ट्यूब तो 125-150 साँस / मिनट पर एक हार्वर्ड मात्रा साइकिल कृंतक वेंटीलेटर साइकिल चालन और 0.1-0.3ml के एक ज्वार की मात्रा से जुड़ा है.
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Acknowledgments
XHTW चिकित्सा अनुसंधान में एक WM उबकना फाउंडेशन गणमान्य युवा विद्वान है, और भी NIH / NHLBI R01-HL089598 अनुदान और R01 - R01HL091947, और पेशी Dystrophy एसोसिएशन 69238 # अनुदान द्वारा समर्थित है. RJvO 2008-2010 अमेरिकी शारीरिक जीनोमिक्स में शारीरिक सोसायटी Postdoctoral फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. यह काम भी CaMKII हार्ट में संकेतन के लिए Fondation Leducq एलायंस द्वारा भाग में समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
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