Summary
Dit protocol laat zien methoden voor de extractie van sperma van de testikels van de mannetjes en daarna inseminatie vrouwelijke muizen. Deze procedure is handig wanneer precieze tijd nodig is in ontwikkeling studies als transgene werken.
Abstract
Knaagdieren van het geslacht Peromyscus (herten muizen) zijn de meest voorkomende inheemse Noord-Amerikaanse zoogdieren. Peromyscus soorten worden gebruikt in een breed scala van onderzoek met inbegrip van toxicologie, epidemiologie, ecologie, gedrags-en genetische studies. Hier bieden ze een nuttig model voor demonstraties van kunstmatige inseminatie.
Methoden zoals die hier weergegeven zijn eerder gebruikt in verschillende herten muizen studies, nog geen gedetailleerd protocol is gepubliceerd. Hier laten we zien de basis methode van kunstmatige inseminatie. Deze methode houdt in extraheren van de testes van de knaagdieren, dan is het isoleren van de zaadcellen uit de bijbal en zaadleiders. De rijpe zaadcellen, die nu in een melkmengsel, worden in de vrouwelijke reproductieve-darmkanaal op het moment van de ovulatie. Bemesting wordt geteld als dag 0 voor de timing van de embryo-ontwikkeling. Embryo's kunnen worden opgehaald op het gewenste tijdstip-point en gemanipuleerd.
Kunstmatige inseminatie kan worden gebruikt in een verscheidenheid van knaagdiersoort waar exact embryo timing is cruciaal of moeilijk te verkrijgen. Deze techniek is van vitaal belang voor soorten of stammen (waaronder de meeste Peromyscus) die niet kunnen paren onmiddellijk en / of waar paring is moeilijk in te schatten. Daarnaast, kunstmatige inseminatie biedt exacte timing voor de ontwikkeling van het embryo, hetzij in kaart brengen van ontwikkeling vooruitgang en / of transgene werk. Verminderde aantallen dieren kunnen worden gebruikt, omdat de bevruchting is gegarandeerd. Deze methode is van vitaal belang voor het bevorderen van de Peromyscus systeem, en hopelijk profiteren anderen.
Protocol
Kunstmatige Inseminatie
Kunstmatige inseminatie is in plaats van natuurlijke dekkingen gebruikt worden om de kans dat alle vrouwtjes hebben zal zwanger toenemen. Twee mannen werd gebruikt voor elke 1 gesuperovuleerde vrouwen of een vrouw bekend is dat in oestrische. De caudae epididymides van de volwassen mannelijke muizen werden geplaatst in een 9% melk suspensie en opengesneden met 18 gauge naalden. Het sperma was vrij kunnen zwemmen voor een paar minuten en vervolgens de epididymides werden genomen uit het mengsel. De suspensie werd geëvalueerd met een microscoop voor samenvloeiing en beweeglijk sperma. Een stomp 22 gauge 1 ½ inch lange naald werd gebruikt om het sperma te beheren. Een 120 °-bocht werd geplaatst ongeveer 3 / 4 e van de weg naar beneden de naald. De naald werd ingebracht in de vagina tot aan de bocht en 0,025 - 0.05mls geïnjecteerd. Als een assistent wordt gebruikt om de vrouwelijke te houden in de juiste positie, is het gebruik van verdovingsmiddelen niet nodig.
Voorbereiding
- Gebruik vier mannen voor zes vrouwen
- Euthanaseren mannetjes op de vivarium
- Bereid ongeveer 5 ml van 9% melk van melkpoeder
- Doe 1,5 ml in kleine petrischaal
- Knip de Epididymus en de zaadleider
- Zet in 1,5 ml van 9% melk
- Met behulp van twee 18 gauge naalden, en het gebruik van lange snijbeweging met naalden, slice open de Epididymus en zaadleider om het sperma op los
- Haal overgebleven weefsel en controleer voor het sperma onder de microscoop
Injectie
- Gebruik stompe naald op 120 ° hoek
- Houd de muis in de hand en injecteer mengsel. Indien een oncomfortabel gevoel met een persoon aanhouden en injecteren, kunnen twee personen worden gebruikt. Geen verdoving te worden gebruikt, als op een weet hoe dit kan invloed hebben op de procedure.
- Gebruik 0.05ml van sperma / melk mix per vrouwtje
Ontvanger vrouwen
- Doe vaginaal uitstrijkje de ontvangende vrouwen (tegen die tijd de ontvanger vrouwen moet worden in pro-oestrus / estrus)
- Vrouwtjes die niet loops bereikt op dag 5 moet waarschijnlijk niet gebruikt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ik wil Mike bedanken Dewey uit de Peromyscus Genetische Stock Center voor zijn waardevolle inzicht, geduld en kennis over knaagdieren reproductie.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
