Summary
Este protocolo demonstra métodos para a extração de espermatozóides dos testículos dos machos e depois inseminação camundongos fêmeas. Este procedimento é útil quando o tempo preciso é necessário em estudos de desenvolvimento bem como o trabalho transgênicos.
Abstract
Roedores do gênero Peromyscus (ratos de cervos) são os mais prevalentes mamíferos nativos da América do Norte. Peromyscus espécies são usadas em uma ampla gama de investigação, incluindo toxicologia, epidemiologia, ecologia, comportamento, e estudos genéticos. Aqui eles fornecem um modelo útil para demonstrações de inseminação artificial.
Métodos semelhantes aos apresentados aqui foram usadas anteriormente em estudos com ratos vários veados, mas nenhum protocolo detalhado foi publicado. Aqui demonstramos o método básico de inseminação artificial. Este método consiste na extração dos testículos dos roedores, em seguida, isolar os espermatozóides do epidídimo e canal deferente. O espermatozóide maduro, agora em uma mistura de leite, são colocados no aparelho reprodutivo da fêmea no momento da ovulação. Fertilização é contado como 0 dias para o sincronismo do desenvolvimento embrionário. Embriões pode ser recuperado no tempo desejado ponto-e manipulado.
A inseminação artificial pode ser usado em uma variedade de espécies de roedores onde o tempo exato de embriões é crucial ou difícil de obter. Esta técnica é vital para as espécies ou variedades (incluindo a maioria Peromyscus) que não podem companheiro imediatamente e / ou onde o acasalamento é difícil de avaliar. Além disso, a inseminação artificial proporciona tempo exato para o desenvolvimento do embrião ou no mapeamento progresso do desenvolvimento e / ou trabalho transgênicos. Redução do número de animais pode ser usado desde a fecundação é garantida. Este método tem sido vital para promover o sistema Peromyscus, e esperamos beneficiar os outros também.
Protocol
Inseminação artificial
A inseminação artificial é usado em vez de cruzamentos naturais para aumentar as chances de que todas as fêmeas têm ficará grávida. Dois do sexo masculino foi usado para cada um fêmeas superovuladas ou uma mulher conhecida por estar no cio. Os epidídimos caudae de camundongos machos adultos foram colocados em uma suspensão de leite 9% e cortados aberto com 18 agulhas. O esperma foi permitido nadar livremente por alguns minutos e depois o epidídimos foram tomadas a partir da mistura. A suspensão foi avaliada com um microscópio de confluência e espermatozóides móveis. A bitola 22 blunt 1 ½ polegada de comprimento agulha foi usado para administrar o esperma. A curva ° 120 foi colocado cerca de 3 / 4 ª a caminho da agulha. A agulha foi introduzida na vagina até a curva e 0,025 - 0.05mls injetado. Se um assistente é utilizado para segurar a fêmea na posição adequada, o uso de anestésicos não é necessário.
Preparação
- Use 4 machos para 6 fêmeas
- Euthanize machos no viveiro
- Prepare cerca de 5 ml de leite de 9% de leite em pó
- Colocar 1,5 ml em placa de Petri pequena
- Cortar os canais deferentes e epidídimo
- Coloque em 1,5 ml de leite de 9%
- Usando duas agulhas 18, e usando movimento de corte de comprimento com agulhas, uma fatia de abrir o epidídimo e ducto deferente para liberar o esperma
- Retire sobra de tecido e verificar se há espermatozóides em microscópio
Injeção
- Use agulha sem corte em ângulo de 120 °
- Segure na mão do mouse e injetar mistura. Se desconfortável com uma pessoa segurando e injetáveis, duas pessoas podem ser usadas. Nenhum anestésico deve ser utilizado, como no se sabe como isso pode influenciar o procedimento.
- Use 0,05 ml de esperma / leite mix por fêmea
Destinatário fêmeas
- Fazer esfregaço vaginal em fêmeas receptoras (por esta altura as fêmeas destinatário devem estar em proestro / estro)
- Fêmeas que não atingiram estro pelo 5 º dia provavelmente não deve utilizar
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Acknowledgments
Gostaria de agradecer a Mike Dewey do Centro de Ações Peromyscus Genéticos para a sua percepção de valor, paciência e conhecimento sobre a reprodução de roedores.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
