Skörd sperma och artificiell insemination av Möss

Summary

Detta protokoll visar metoder för att utvinna spermier från testiklarna på hanar och sedan inseminating honmöss. Detta förfarande är användbart när exakt tid behövs utvecklingsstudier samt transgena arbete.

Abstract

Gnagare av släktet Peromyscus (rådjur möss) är de vanligaste infödda nordamerikanska däggdjur. Peromyscus arter används i ett brett spektrum av forskning inklusive toxikologi, epidemiologi, ekologi, beteende och genetiska studier. Här de ger en användbar modell för demonstrationer av artificiell insemination.

Metoder liknande dem som visas här har tidigare använts i flera studier rådjur mus, men inga detaljerade protokoll har publicerats. Här kan vi visa den grundläggande metoden för artificiell insemination. Denna metod innebär att utvinna testiklarna från gnagare, sedan isolera spermier från bitestiklarna och sädesledarna. Den mogna spermier, nu i en mjölk-blandning, placeras i honans reproduktionsorgan vid tiden för ägglossning. Befruktning räknas som dag 0 för tidpunkten för embryots utveckling. Embryon kan sedan hämtas vid önskad tid-punkt och manipuleras.

Artificiell insemination kan användas i en mängd olika arter av gnagare där exakta embryot timing är avgörande, eller svårt att få. Denna teknik är avgörande för arter eller stammar (inklusive de flesta Peromyscus) som inte kan para sig omedelbart och / eller där parning är svårt att bedöma. Dessutom ger insemination exakt tidpunkt för embryots utveckling antingen i kartläggningen utvecklingsarbete pågår och / eller transgena arbete. Minskat antal djur kan användas då befruktning är garanterad. Denna metod har varit avgörande för att främja Peromyscus systemet, och kommer förhoppningsvis att gynna andra.

Protocol

Artificiell insemination

Artificiell insemination används i stället för naturliga parningar för att öka chanserna att alla kvinnor har att bli gravid. 2 män har använts för varje 1 superovulated honor eller en kvinnlig känd för att vara i estrous. Den caudae bitestiklar från mogna hanmöss placerades i en 9% mjölk fjädring och skivad öppna med 18 gauge nålar. Spermierna fick simma fritt i några minuter och sedan bitestiklar togs från blandningen. Suspensionen utvärderades med ett mikroskop för sammanflödet och rörliga spermier. Ett trubbigt 22 gauge 1 ½ cm lång nål användes för att administrera spermier. En 120 ° böj placerades cirka 3 / ^{4: e} vägen ner nålen. Nålen sattes in i slidan upp till böja och 0,025 - 0.05mls injiceras. Om en assistent används för att hålla den kvinnliga i lämpligt läge, är användningen av bedövning inte behövs.

Förberedelser

1. Använd 4 hanar i 6 tikar
2. Euthanize hanar vid vivarium
3. Förbered ca 5 ml 9% mjölk från mjölkpulver
4. Sätt 1,5 ml i små petriskål
5. Klipp ut epididymus och sädesledaren
6. Sätt i 1,5 ml med 9% mjölk
7. Med hjälp av två 18 gauge nålar, och med långa skärande rörelse med nålar, skiva öppna epididymus och sädesledaren att frigöra spermier
8. Ta ut vänster över vävnaden och kontrollera om spermier i mikroskop

Injektion

1. Använd trubbig nål vid 120 ° vinkel
2. Håll musen i handen och injicera blandning. Om obekväm med en person som innehar och injicera, kan två människor användas. Inga bedövningsmedel ska användas, som på en vet hur detta kan påverka proceduren.
3. Användning 0,05 ml sperma / mjölk blandningen per hona

Mottagare kvinnor

1. Har vaginal smetar på mottagaren kvinnor (vid denna tid mottagaren honorna ska vara i proestrus / brunst)
2. Kvinnor som inte har nått estrus av Dag 5 bör nog inte användas

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-772-30
18 G needle	Tool	BD Biosciences	305195
Powdered milk	Reagent	Any Supplier
1 mL syringe	Tool	National Scientific Company	S7510-1
Forceps	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14200-075
22 G blunt needle	Tool	Give to me