Summary
Одной из особенностей болезни Альцгеймера является повышение Ар
Abstract
Обесценение синаптических связей, скорее всего, лежат в основе тонких амнезии изменения, происходящие на ранних стадиях болезни Альцгеймера с (AD). β-амилоида (Ар), пептид, производимых в больших количествах в AD, как известно, уменьшает долговременной потенциации (LTP), сотовые коррелят обучения и памяти. В самом деле, LTP нарушения вызваны Ар является полезным экспериментальную парадигму для изучения синаптической дисфункции в нашей эры моделей и для скрининга препаратов способны смягчения или возврат таких синаптических нарушений. Исследования показали, что Ар производит LTP нарушения преимущественно через его олигомерные формы. Здесь мы предлагаем подробный протокол по нарушению LTP по перфузии олигомеризации синтетических Aβ1-42 пептида на острые срезах гиппокампа. В этом видео мы опишем шаг за шагом, порядок подготовки олигомерных Ар
Protocol
Ресуспендирования β-амилоида пептида
Прежде, чем начать есть готовые:
- Ар 1-42 (лиофилизированный порошок)
- 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP)
- Низкий-связывающий полипропилена микроцентрифужных труб (1,5 мл)
- Газонепроницаемыми Гамильтон шприц с тефлоновым окунуться остановить (250 мкл)
- Диметилсульфоксид (ДМСО)
- Разрешить лиофилизированный Ар 1-42 до уравновешивания при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы избежать конденсации при открытии пептид флаконе.
- Под вытяжным шкафом, вновь приостановить Ар 1-42 пептида в ледяной HFIP получить 1 мМ раствора и вихревые решения в течение нескольких секунд.
- Использование стекла газонепроницаемыми Гамильтон шприц с пробкой тефлон, быстро разделить Ар 1-42 / HFIP решение в равной степени на три флаконах полипропиленовых и печатью ампул.
- Флаконы затем инкубировали в течение 2 часов, чтобы обеспечить Ар monomerization. Затем откройте флаконов и сосредоточиться Ар 1-42 / HFIP раствора под вакуумом с помощью центрифуги SpeedVac (800 г, комнатной температуры), пока прозрачная пленка пептида наблюдается на дне флакона. Тщательно проверьте температуру внутри SpeedVac центрифуге, чтобы избежать деградации пептида (не более 25 ° С).
- Печать флаконов и хранить аликвоты при -80 ° C. Ар пленку можно хранить в течение 6 месяцев.
- Повторное приостановить один фильм, добавив ДМСО, чтобы получить концентрацию до 5 мм Ар 1-42. Разрушать ультразвуком в водяной бане в течение 10 минут, чтобы полностью изменить подвеску.
- Алиготе этом 5 мМ Ар 1-42 решения в полипропиленовые флаконы. Закройте все флаконы и хранить их при температуре -20 ° C. Порции должны быть разморозить только один раз. Остерегайтесь конденсации воды внутри морозильной камеры. Пептидов в растворе подвержен очень легко.
Олигомеризации
Прежде, чем начать есть готовые:
- Ар 1-42 / ДМСО (5мм)
- Стерильные фосфатного буфера
- Низкий-связывающий полипропилена микроцентрифужных труб (1,5 мл)
- Низкий-связывающий полипропиленовые центрифужные пробирки (50 мл)
- Развести полученный 5 мМ Ар 1-42 / ДМСО аликвоту стерильной фосфатного буфера (до 100 мкл).
- Vortex в течение 30 секунд, а затем инкубируют в течение 12 часов при температуре 4 ° C
Гиппокампа лечение ломтик
При лечении срезах гиппокампа, важно, чтобы избежать неспецифической адгезии пептида на стаканах, поверхностей перфузии труб, и записи камеры. Использование преимущественно низкой обязательным трубы полипропиленовые и контейнеры. Избегайте использования изделий из стекла или общие пластиковой посуды. Перфузии СМИ должны быть сыворотки или альбумин-бесплатно.
Ар перфузии
Прежде, чем начать есть готовые:
- Олигомеризации Ар 1-42
- Запись буфера (в мм: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 25 3 NaHCO, CaCl 2 2, 2 MgCl 2 и 10 глюкоза)
- Электрофизиологические записи настройки камеры с интерфейсом
- Поперечные срезах гиппокампа инкубировали в кислородом буфера записи, по крайней мере 90 минут после вскрытия (Т = 29 ° С; постоянной скоростью перфузии = 2 мл / мин)
- Непосредственно перед экспериментом, развести Ар олигомеризации 1-42 аликвоту до соответствующей концентрации рабочих (200 нм и выше) в полипропиленовые трубы с предварительной кислородом записи буфера.
- Заливать Ар 1-42 решение в течение 20 минут, чтобы ломтики до индукции синаптической пластичности.
Индукция пластичность и последующей
- Как правило, наиболее широко используемой модели синаптической пластичности LTP. Он может быть вызван через тетаническое стимуляции данной синапс в гиппокампе. Мы поля записи ответов от синапсов между залога прогнозы Шаффер и СА1 пирамидальных нейронов в radiatum слоя. Наши тетаническое стимуляции состоит из стимуляции тета взрыв, который включает 3 поезда, разделенных 15-секундным интервалом. Каждый поезд состоит из 10 очередей на 5 Гц, где каждый взрыв влечет за собой 5 импульсов в 100 Гц. Применить тетаническое стимуляцию сразу после перфузии олигомеризации Ар была завершена.
- Сразу же после тетаническое стимуляции вернуться к нормальной перфузии с буфером записи. Поддержание постоянной скорости перфузии, записи температуры камеры и надлежащего оксигенации на протяжении всего эксперимента.
Представитель результаты и возможные проблемы
Ар олигомеризации по классическому протоколу Стайн и др. Сб. 1, генерирует Ар мономеров и олигомеров разнообразие различных размеровс (димеров, тримеров и т. д.) перфузии олигомеризации Ар 1-42 ведет к снижению LTP в Ар обработанных ломтиками по сравнению с контрольными срезами. В наших экспериментальных условиях, где 3-5 месяца C57BL/6J самцов мышей используются, LTP в 200 нМ Ар обработанных срезов в среднем 150% от базовой стоимости на два часа после тетаническое стимуляцию, в то время как в контрольной ломтиками LTP значения в среднем 200-250% от baseline2. В некоторых случаях лечение с Ар может не уменьшить гиппокампа LTP. Несколько критических ошибок, которые могут возникнуть включают чрезмерное фильма во время сушки Ар концентрации и неполной олигомеризации. Ар перфузии в срезах гиппокампа может быть другой источник беспокойства из-за физико-химическими свойствами Ар пептида в растворе, который ведет к неспецифической адгезии к пластмассам. Устранение этих вопросов обсуждается ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как описано выше, ряд проблем в подготовке олигомерных Ар может привести к незатронутым LTP. Один из способов оценить, насколько Ар деградации или отсутствие Ар олигомеризации, возможно, произошли является оценка Ар подготовки использованием ТРИС-Tricine СТРАНИЦА / Западная блоттинг анализа и аналитического ультрацентрифугирования (не описанных в данном протоколе). Когда западные Blotting образцы подготовлены под non-denaturing/non-reducing условиях успешной подготовки должна генерировать Вестерн-блоттинг подпись показывая полос, соответствующих мономеров и олигомеров различной 3. Часто встречающихся вопрос пептид нестабильности во время сушки шаг в SpeedVac концентратора. На самом деле, высокотемпературная сушка приводит к деградации белка, заметное выраженной окраской пептида до коричневого. Концентрация раствора HFIP должна осуществляться при комнатной температуре и под тщательным наблюдением. Учитывая ряд процедурных шагов, происходящих в протокол, ошибки в разведении может случайно привести к ухудшению олигомеризации или вводящей в заблуждение концентрации Ар. Интересно, что перфузия Ар концентрации ниже, чем предложили бы привести к увеличению значения LTP 3. Опять же, сказывается на перфузии возможный исход Ар лечения на ломтики. В самом деле, поддержание постоянной температуры ванны решение в нашу электрофизиологических экспериментов является критическим, как температура, как известно, влияют на Ар конформации, когда решается в фосфатного буфера. Другим источником беспокойства является то, что олигомерные Ар могут неспецифически придерживаться пластиковых поверхностей контейнеров и труб используется для приготовления и перфузии снижая тем самым эффективную концентрацию подвергается срезах гиппокампа. Таким образом, важно использовать низкого связывания с белками пластиковой посуды для обеспечения надежных препаратов и перфузии в различные эксперименты. В этом номере мы предлагаем полипропиленовые пластиковой посуды, который был показан, чтобы не влиять на соотношение различных видов Ар 4. Обширная литература о том, что болезнь Альцгеймера возникает как синаптические расстройства 5. Вполне вероятно, что тонкость и изменчивость ранние симптомы амнезии, происходящие в отсутствие каких-либо других клинических признаков повреждения мозга, связаны с дискретными изменениями в функции одного синапса, произведенные по крайней мере частично, Ар видов ( например, Ар 42 и Ар 40) 2,6,7,8. Открытие, что препарат, содержащий синтетический олигомеризации Ар 1-42 может нарушить LTP 9 в пробирке привело к многочисленным исследованиям в механизмах синаптической дисфункции индуцированных Ар возвышение в мозг. Используя этот протокол, мы описываем процедуру подготовки олигомерных Ар, который успешно препятствует LTP на Шаффер залога слой radiatum связи в срезах гиппокампа. Эта экспериментальная парадигма имеет огромное значение для исследования механизмов Ар-опосредованного патогенеза, а также тестирование потенциальных лекарственных препаратов, которые могут смягчить синаптической дисфункции 2,10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Колумбийского университета IACUC.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
