Summary
알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의 상승입니다
Abstract
시냅스 연결의 장애가 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 발생하는 미묘한 amnesic 변경 사항을 기초로 가능성이 높습니다. β - 아밀로이드 (Aβ), AD 높은 금액에서 생산되는 펩티드는 세포가 학습과 기억의 상관 관계를 장기 Potentiation (LTP)을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다. 사실, Aβ에 의한 LTP 장애는 AD 모델과 같은 신경 손상을 완화하거나 되돌리는 능력 심사 약물에 대한 신경 장애를 공부에 유용한 실험 패러다임이다. 연구 Aβ는 oligomeric 양식을 통해 우선적으로 LTP 장애를 생산하는 것으로 나타났습니다. 여기 oligomerized 합성의 재관류에 의해 급성 hippocampal 조각에 Aβ1 - 42 펩타이드를 혼란 LTP에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 oligomeric Aβ의 준비를위한 단계별 절차를 설명합니다
Protocol
Resuspending β - 아밀로이드 펩타이드
시작하기 전에 준비했습니다 :
- Aβ 1-42 (동결 건조된 분말)
- 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)
- 낮은 결합 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브 (1.5 ML)
- 테플론 동작 정류장 (250 μl)와 GasTight 해밀턴 주사기
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- 동결 건조된 Aβ 1-42은 펩타이드 병을 열 때 응축을 피하기 위해 30 분 실온에서 평형 수 있습니다.
- 펌 후드 아래, 1 MM 솔루션과 몇 초 동안 와동 솔루션을 얻기 위해 추운 얼음 HFIP에서 Aβ 1-42 펩타이드를 다시 일시 중지합니다.
- 테플론 플러그와 유리 GasTight 해밀턴 주사기를 사용하여 신속하게 동일하게 세 폴리 프로필렌의 튜브에 Aβ 1-42 / HFIP 솔루션을 분할하고 튜브를 밀봉.
- 튜브는 다음 Aβ monomerization 수 있도록 2 시간 incubated 수 있습니다. 다음 튜브를 열고 맑은 펩타이드 영화는 유리병의 하단에 관찰된 때까지 SpeedVac 원심 분리기 (800g, 실온)을 사용하여 진공에서 Aβ 1-42 / HFIP 솔루션을 집중. (최대 25 ° C) 펩타이드 저하를 피하기 위해 SpeedVac 원심 내부 신중하게 온도를 확인합니다.
- 튜브를 밀봉하고 -80에서 aliquots를 저장 ° C. Aβ 영화는 6 개월 동안 저장할 수 있습니다.
- 5 MM Aβ 1-42까지 농도를 얻을 DMSO를 추가하여 한 영화를 다시 일시 중지합니다. 다시 정지 완성하기 위해 10 분 동안 물 목욕으로 Sonicate.
- 폴리 프로필렌의 튜브로 나누어지는이 5mM Aβ 1-42 솔루션입니다. 모든 튜브를 밀봉하고 -20 ° C.에 그들을 저장 Aliquots는 한 번만 해동해야합니다. 냉동실 내부에 물이 응축주의. 솔루션에서 펩티드 아주 쉽게 저하.
Oligomerization
시작하기 전에 준비했습니다 :
- Aβ 1-42 / DMSO (5mM)
- 멸균 인산 버퍼
- 낮은 결합 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브 (1.5 ML)
- 낮은 결합 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 (50 ML)
- 얻은 5mM Aβ 1-42 / 멸균 인산 버퍼 (최대 100 μl)와 DMSO의 나누어지는을 희석.
- 30 초 동안 소용돌이 그리고 4에서 12 시간 동안 품어 ° C
Hippocampal 슬라이스 처리
hippocampal 조각 치료 때, 비커, 재관류 튜빙 표면 및 녹음 챔버에 비 특정 펩타이드의 부착을 방지하는 것이 중요합니다. 낮은 결합 폴리 프로필렌 튜빙과 용기 우선적으로 사용합니다. 유리 또는 플라스틱 - 도자기 일반의 사용을 피하십시오. 재관류 미디어는 혈청 또는 알부민 무료되어야합니다.
Aβ 재관류
시작하기 전에 준비했습니다 :
- Oligomerized의 Aβ 1-42
- 레코딩 버퍼 (㎜의 : 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 나 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 포도당)
- 인터페이스 챔버로 설정 Electrophysiological 기록
- 최소 90 분간 사후 해부를위한 산소 기록 버퍼에 incubated 트랜스 hippocampal 조각 (T = 29 ° C, 지속적인 재관류 율은 = 2 ML / 분)
- 바로 전에 실험, 사전 산소 기록 버퍼와 폴리 프로필렌 튜브에서 해당 작업 농도 (200 NM 이상)에 oligomerized의 Aβ 1-42 나누어지는을 희석.
- 시냅스 소성의 유도 전에 조각 20 분 동안 Aβ 1-42 솔루션을 Perfuse.
소성의 유도 및 후속
- 일반적으로 시냅스 소성의 가장 널리 사용되는 모델은 LTP입니다. 이것은 해마에 주어진 버렸네의 파상풍의 자극을 통해 유도하실 수 있습니다. 우리는 샤퍼의 부수적인 전망과 지층의 radiatum의 CA1 피라미드 뉴런 사이의 시냅스에서 현장 응답을 기록합니다. 우리 파상풍의 자극을 15 초 간격으로 구분된 세 열차를 포함하는 세타 버스트 자극으로 구성되어 있습니다. 각 열차는 각 버스트은 100 Hz에서에서 5 펄스를 수반 5 Hz에서 10 파열로 구성되어 있습니다. oligomerized Aβ의 재관류가 완료되어 즉시 파상풍의 자극을 적용합니다.
- 파상풍의 자극은 정상적인 녹음 버퍼와 재관류로 다시 전환 직후. 실험 기간에 걸쳐 지속적인 관류 속도, 기록 챔버 온도와 적절한 산소를 유지합니다.
대표 결과 및 가능한 문제
스타인 동부 표준시 콜의 전통적인 프로토콜입니다. 1에 따라 oligomerized Aβ는 Aβ 단량체 및 다양한 다른 크기의 oligomers를 생성S (이량체, trimer, 등) oligomerized의 재관류 제어 조각에 비해 Aβ - 취급 조각 감소 LTP에 Aβ 1-42 연결됩니다. 제어 조각에 LTP 가치가있는 동안 3~5개월 된 C57BL/6J 남성 마우스가 사용하는 우리의 실험 조건에서 LTP 200 NM에서 Aβ - 처리 슬라이스는 파상풍 자극 이후 두 시간에 기준 값을 평균 1백50%에 baseline2의 평균 200~250%에. 어떤 경우에는 Aβ와 치료 hippocampal LTP을 줄이기 위해 실패할 수 있습니다. 발생할 수있는 몇 가지 중요한 오류가 Aβ 농도와 불완전 oligomerization 동안 건조 과도한 필름을 포함합니다. hippocampal 조각의 Aβ 재관류는 우려 때문에 플라스틱이 아닌 특정 부착하는 경향이있다 솔루션 Aβ 펩타이드의 물리 특성의 또 다른 원천이 될 수 있습니다. 이러한 문제의 해결은 아래 설명되어 있습니다.
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Discussion
위에서 설명한 바와 같이, oligomeric Aβ의 준비에 몇 가지 문제가 손상되지 않은 LTP가 발생할 수 있습니다. Aβ 열화 또는 Aβ oligomerization의 부족이 발생했을 수 있는지 여부를 평가하는 한 가지 방법은 트리스 - Tricine 페이지 웨스턴 / 모래 바닥 분석 및 분석 ultracentrifugation (이 프로토콜에서 설명하지 않은)를 사용하여 Aβ 준비를 평가하는 것입니다. 서양 모래 바닥 샘플 non-denaturing/non-reducing 조건 하에서 준비가되면, 성공적인 준비 단량체와 다른 oligomers 3에 해당하는 대역을 갖춘 서양 모래 바닥 서명을 생성한다. 자주 발생하는 문제는 SpeedVac 농축기에서 건조 단계에서 펩타이드 불안정성이다. 사실, 고온 건조는 갈색으로 표시 펩타이드의 착색에 의해 눈에 띄게, 단백질 저하로 연결됩니다. HFIP 솔루션의 농도는 신중하게 상온에서 실시하고 모니터링할 수 있습니다. 프로토콜에서 발생 몇 가지 절차적 단계를 감안할 때, 희석에 오류가 실수로 가난한 oligomerization 또는 오해의 소지가 Aβ의 농도가 발생할 수 있습니다. 흥미롭게도, 제안보다 낮은 Aβ 농도로 살포는 증가 LTP 값 3을 나타날 수 있습니다. 다시 재관류는 조각에 Aβ 치료의 가능한 결과에 영향을 미칩니다. 사실, 우리 electrophysiological 실험에서 목욕 솔루션의 일정한 온도를 유지하면 온도가 인산염 버퍼에서 해결하면 Aβ conformations에 영향을 미칠 것으로 알려져으로 중요합니다. 관심의 또 다른 원천은 oligomeric Aβ가 아닌 구체적으로이를 hippocampal 조각에 노출된 효과적인 농도를 감소 준비 및 재관류에 사용되는 용기 튜브의 플라스틱 표면에 충실 수있다는 것입니다. 그러므로, 그것은 다른 실험을 통해 신뢰할 수있는 준비와 perfusions을 보장하기 위해 낮은 단백질 바인딩 플라스틱웨어를 사용하는 것이 중요합니다. 이 문제에서 우리는 다른 Aβ 종 4의 비율에 영향을 미치지 않도록 표시되었습니다 폴리 프로필렌 플라스틱 - 도자기를 만나볼 수 있습니다. 광범위한 문학은 알츠하이머 병은 신경 장애 5 비롯된 것이 좋습니다. 그것은 뇌 손상의 다른 임상 징후의 부재에서 발생하는 가장 오래된 amnesic 증상의 미묘하고 다양성은, Aβ 종류에 의해 적어도 부분에서 생산되는 단일 버렸네의 기능에 이산 변경 (로 인해 발생 가능성이 높습니다 예 Aβ 42 Aβ 40) 2,6,7,8. oligomerized 합성 Aβ 1-42을 포함하는 준비가 체외에서 LTP 9 손상 수있는 발견은 두뇌에서 Aβ 상승에 의해 유도된 신경 장애의 메커니즘에 수많은 조사되었다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 hippocampal 조각에 샤퍼 담보물 - 지층 radiatum 연결에서 LTP를 impairs oligomeric Aβ를 준비 절차를 설명합니다. 이 실험 패러다임은 Aβ - 중재 pathogenesis의 메커니즘을 조사뿐만 아니라 신경 기능 장애에게 2,10,11을 완화 수있는 잠재적인 약물을 테스트하기 위해 엄청난 가치가있다.
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Disclosures
동물 실험은 컬럼비아 대학 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 NIH 국립 연구소 (NINDS) (NS049442)에 의해 지원되었다.>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
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