Summary
Een kenmerk van de ziekte van Alzheimer is de hoogte van Aß
Abstract
Bijzondere waardevermindering van synaptische verbindingen is waarschijnlijk de subtiele amnesic veranderingen die zich op de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer s (AD) ten grondslag liggen. β-amyloïde (Aß), een peptide geproduceerd in grote hoeveelheden in AD, is bekend dat het Long-Term Potentiëring (LTP), een cellulaire correlaat van leren en geheugen te verminderen. Inderdaad, LTP bijzondere waardevermindering wordt veroorzaakt door Aß is een nuttig experimenteel paradigma voor het bestuderen van synaptische disfuncties in AD modellen en voor het screenen van geneesmiddelen die in staat van verzachtende of terugkeer dergelijke synaptische bijzondere waardeverminderingen. Studies hebben aangetoond dat Aß de LTP verstoring bij voorkeur produceert via zijn oligomere vorm. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor afbreuk te doen aan LTP door perfusie van oligomerized synthetische Aβ1-42 peptide op acute hippocampus plakjes. In deze video, schetsen we een stap-voor-stap procedure voor de voorbereiding van oligomere Aß
Protocol
Het mengen β-amyloïde peptide
Voordat u begint zijn klaar:
- Aß 1-42 (gevriesdroogd poeder)
- 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP)
- Low-bindende polypropyleen microcentrifugebuizen (1,5 ml)
- Gasdicht Hamilton spuit met Teflon duiken stop (250 pl)
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- Laat gelyofiliseerd Aß 1-42 op kamertemperatuur equilibreren gedurende 30 minuten om condensatie te voorkomen bij het openen van het peptide flacon.
- Onder de zuurkast, opnieuw te schorten Aß 1-42 peptide in ijskoud HFIP om een een mM oplossing en vortex de oplossing voor een paar seconden te verkrijgen.
- Met behulp van een glazen gasdicht Hamilton injectiespuit met Teflon stekker, snel verdelen de Aß 1-42 / HFIP oplossing even in drie polypropyleen flacons en sluit de flacons.
- De flesjes worden vervolgens geïncubeerd gedurende 2 uur om zorgen voor Aß monomerization. Open vervolgens de flesjes en de concentratie van de Aß 1-42 / HFIP oplossing onder vacuüm met behulp van een SpeedVac centrifuge (800 g, op kamertemperatuur) tot een duidelijke peptide film wordt waargenomen op de bodem van de flesjes. Controleer zorgvuldig de temperatuur in de SpeedVac centrifuge om peptide degradatie te voorkomen (max 25 ° C).
- Sluit de flesjes en bewaar de monsters bij -80 ° C. Aß film kan worden opgeslagen voor 6 maanden.
- Opnieuw te schorsen een film door het toevoegen van DMSO tot een concentratie te verkrijgen tot en met 5 mM Aß 1-42. Ultrasone trillingen in het waterbad gedurende 10 minuten om te zorgen voor een volledige re-ophanging.
- Aliquot deze 5mM Aß 1-42 oplossing in polypropyleen flacons. Afdichting alle flacons en bewaar ze bij -20 ° C. Monsters mag slechts een keer worden ontdooid. Pas op voor condensatie van waterdamp in de vriezer. Peptiden in oplossing degraderen heel gemakkelijk.
Oligomerisatie
Voordat u begint zijn klaar:
- Aß 1-42 / DMSO (5mm)
- Steriele fosfaatbuffer
- Low-bindende polypropyleen microcentrifugebuizen (1,5 ml)
- Low-bindende polypropyleen centrifugebuis (50 ml)
- Verdun de verkregen 5mM Aß 1-42 / DMSO aliquot met steriele fosfaatbuffer (tot 100 pi).
- Vortex gedurende 30 seconden en daarna incubeer gedurende 12 uur bij 4 ° C
Hippocampale slice behandeling
Bij de behandeling van hippocampale slices, is het belangrijk om te voorkomen dat niet-specifieke peptide hechting op bekers, perfusieslang oppervlakken, en de opname kamer. Gebruik bij voorkeur een lage-bindende polypropyleen buizen en containers. Vermijd het gebruik van glaswerk of algemene plastic-ware. Perfusie media moeten serum-of albumine-vrij.
Aß perfusie
Voordat u begint zijn klaar:
- Oligomerized Aß 1-42
- Opname buffer (in mm: 124 NaCl, KCl 4,4, een Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, en 10 glucose)
- Elektrofysiologische opname set-up met interface kamer
- Dwars hippocampale plakken geïncubeerd in zuurstof opname buffer voor ten minste 90 minuten na dissectie (T = 29 ° C; constante perfusie snelheid = 2 ml / minuut)
- Onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, verdunnen de oligomerized Aß 1-42 hoeveelheid op de juiste werking concentratie (200 nM of hoger) in een polypropyleen buisje met pre-zuurstof opname buffer.
- Perfuseren de Aß 1-42 oplossing gedurende 20 minuten tot de plakjes voor de inductie van synaptische plasticiteit.
Inductie van plasticiteit en follow-up
- Typisch, het meest gebruikte model van synaptische plasticiteit is het LTP. Het kan worden opgewekt door middel van tetanische stimulatie van een bepaalde synaps in de hippocampus. We nemen veld reacties van de synapsen tussen zekerheid van de Shaffer's projecties en CA1 pyramidale neuronen in het stratum radiatum. Onze tetanische stimulatie bestaat uit een theta burst stimulatie die drie treinen van elkaar gescheiden door intervallen van 15 seconden opgenomen. Elke trein bestaat uit 10 barst op 5 Hz, waar elke burst 5 pulsen met zich meebrengt bij 100 Hz. Breng de tetanische stimulatie onmiddellijk na de perfusie van oligomerized Aß is afgerond.
- Direct na de tetanische stimulatie terug te schakelen naar perfusie met normale opname buffer. Een constante perfusie snelheid, het opnemen van kamertemperatuur en een goede oxygenatie tijdens de gehele duur van het experiment.
Representatieve resultaten en mogelijke problemen
De Aß oligomerized volgens de klassieke protocol van Stine et coll. 1, genereert Aß monomeren en een verscheidenheid van oligomeren van verschillende groottes (dimeer, trimeer, enz.) De perfusie van oligomerized Aß 1-42 leidt tot een verminderde LTP in Aß-behandelde schijfjes vergeleken met de controlegroep plakken. Onder onze experimentele omstandigheden, waar de 3-5 maanden oud C57BL/6J mannelijke muizen worden gebruikt, LTP in 200 nM Aß behandelde plakken is gemiddeld 150% van de uitgangswaarden op twee uur na de tetanische stimulatie, terwijl het in control plakjes LTP waarden zijn gemiddeld 200 tot 250% van de baseline2. In sommige gevallen kan behandeling met Aß niet aan de hippocampus LTP te verminderen. Een aantal kritieke fouten die kunnen optreden zijn onder overmatige film drogen tijdens Aß concentratie en onvolledige oligomerisatie. Aß perfusie in de hippocampus plakken zou een andere bron van zorg als gevolg van de fysisch-chemische eigenschappen van de Aß peptide in oplossing, die gevoelig is voor niet-specifieke hechting aan kunststoffen worden. Het oplossen van deze problemen wordt hieronder besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven beschreven, kunnen verschillende problemen bij de voorbereiding van oligomere Aß resulteren in onverkort van LTP. Een manier om te beoordelen of Aß degradatie of het ontbreken van Aß oligomerization kan hebben plaatsgevonden is het evalueren van de Aß voorbereiding met behulp van TRIS-Tricine PAGE / Western blotting analyse en analytische ultracentrifuge (niet beschreven in dit protocol). Wanneer Westerse Blotting monsters worden bereid onder non-denaturing/non-reducing voorwaarden kan het een succesvolle voorbereiding het genereren van een Western Blot handtekening met bands die overeenkomen met monomeren en verschillende oligomeren 3. Een vaak voorkomend probleem is het peptide instabiliteit tijdens het drogen stap in de SpeedVac concentrator. In feite, hoge temperatuur drogen leidt tot afbraak van eiwitten, zichtbaar door duidelijke peptide kleuring tot bruin. Concentratie van de HFIP oplossing moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en bewaakt zorgvuldig. Gezien de verschillende procedurele stappen die voorkomen in het protocol, kunnen fouten in de verwatering per ongeluk leiden tot slechte oligomerisatie of misleidend Aß concentratie. Interessant, zou de perfusie met Aß-concentraties lager dan gesuggereerd resulteren in een verhoogde LTP waarden 3. Nogmaals, perfusie van invloed op de mogelijke uitkomst van Aß behandeling op plakjes. Inderdaad, het handhaven van een constante temperatuur van het bad oplossing in onze elektrofysiologische experimenten is van cruciaal belang als de temperatuur bekend is Aß conformaties beïnvloeden wanneer opgelost in fosfaatbuffer. Een andere bron van zorg is dat oligomere Aß kunnen ook niet-specifiek vasthouden aan kunststof oppervlakken van containers en slangen worden gebruikt voor de voorbereiding en perfusie waardoor de effectieve concentratie blootgesteld aan hippocampale slices. Zo is het essentieel om een laag-eiwit binding plastic-ware gebruiken om een betrouwbare voorbereidingen en perfusie in heel verschillende experimenten te garanderen. In dit nummer stellen we polypropyleen plastic-ware waarvan is aangetoond dat niet aan de verhouding van de verschillende soorten Aß 4 beïnvloeden. Uitgebreide literatuur suggereert dat de ziekte van Alzheimer ontstaat als een synaptische stoornis 5. Het is waarschijnlijk dat de subtiliteit en de variabiliteit van de vroegste symptomen van geheugenverlies, die zich in de afwezigheid van andere klinische tekenen van hersenletsel, zijn het gevolg van discrete veranderingen in de functie van een enkele synaps, ten minste in een deel, door Aß soort ( bijvoorbeeld Aß 42 en Aß 40) 2,6,7,8. De ontdekking dat een preparaat met oligomerized synthetische Aß 1-42 kan LTP 9 aantasting in vitro heeft geleid tot tal van onderzoeken naar de mechanismen van synaptische dysfunctie veroorzaakt door Aß verheffing in de hersenen. Met behulp van dit protocol beschrijven we een procedure voor het bereiden van oligomere Aß die met succes LTP afbreuk aan de Shaffer onderpand stratum radiatum verbinding in de hippocampus plakjes. Deze experimentele paradigma heeft een enorme waarde voor het onderzoeken van mechanismen van Aß-gemedieerde pathogenese, alsmede het testen van potentiële geneesmiddelen, die synaptische dysfunctie te beperken 2,10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving weer door de Columbia University IACUC in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
