Summary
本文演示兔眼视网膜和颗粒介导的基因转染质粒编码绿色荧光蛋白或为视网膜神经节细胞的亚细胞标记的各种的解剖和孵化。
Abstract
功能的神经组织器官型培养系统在神经生物学研究的重要工具。理想的情况下，这种成像技术，遗传操作，电生理记录系统应兼容。在这里，我们提出了一个简单，无需专门的设备和很少的维护成年兔视网膜相间组织文化系统。我们展示了兔眼视网膜和颗粒介导的基因转染质粒编码绿色荧光蛋白或为视网膜神经节细胞的亚细胞标记的各种的解剖和孵化。培养兔视网膜至6天的整体解剖结构很少变化或个别的形态神经节和无长突细胞，这样，才能保持活力。
Protocol
基因枪子弹（金）
- 100X的PVP（0.5mg/ml的），100％乙醇。
- 称取30毫克和BioRad公司1.6微米的微载体的黄金放入1.5 mL Eppendorf管。
- 计算所需的质粒浓度0.5-3微克/毫克质粒黄金，并放入管与黄金微载体的质粒。如果需要组合几个质粒。
- 携带质粒100μL，用蒸馏水量。
- 添加到管100μL0.05M亚精胺。涡管30秒。
- 涡旋1分钟全速。超声为3-5分钟..
- 干TEFZEL管BIORAD PDS-1000/He仪器在15分钟的适当长度。
- 经过超声，涡流为1-2分钟全速。降低速度慢，让管被打开，而涡旋。
- 加入100μL的1 M 氯化钙慢慢管降明智而震荡。
- 留在室温下10分钟的管。
- 设为5微米过滤器。
- 取两个5ml注射器没有针头。
- 取出柱塞，取下黑色帽子。以小剪刀，切断了黑帽给一环的一部分。重复其他柱塞净两枚戒指。
- 5微米之间两环（小零件，公司尼龙过滤器，2.5英寸直径）过滤器，并推入注射器的尖端夹心三明治。
- 耳环注射器超过50ml的锥形瓶中。
- 10分钟后，涡管为30秒。
- 离心管为30秒和保存沉淀。
- 添加100％的乙醇以沉淀1毫升。使用枪头分手颗粒，和旋涡30秒。旋转30秒，并除去乙醇。重复2次以上。
- 1ml至100％的乙醇添加颗粒（打破用tip）。放入5微米的过滤器，并让重力，通过它流入50ml的锥形管。需要洗出与流量管或帮助通过使用更多的乙醇。
- 转速2000RPM50毫升管离心5-10分钟。去除上清液，保存颗粒。
- 根据所需的微载体的密度，加入800μl1.5毫升100％乙醇和相应的8μL，15μLPVP的解决方案。
- 漩涡和马上去BIORAD PDS-1000/He仪器。
- BIORAD PDS-1000/He仪
- 氮气罐连接断开的管干燥管
- 取出干燥机TEFZEL管
- 一端插入到50ml的锥形管，注射器和附加油管的另一端。褐色泥浆吸进管中。
- 机插入油管回。
- 4分钟的等待（不旋转）
- 4分钟后，吸乙醇缓慢，仔细，确保不打扰微载体。
- 1分钟旋转的油管。
- 1分钟后，连接管连接的N 2储气罐干燥管，让干管为15分钟。
- 15分钟后，切管，立即使用，或在4 ° C储存在exsiccator子弹大小。子弹可以存储长达3个月。
制备基因枪
- 将墨盒放置子弹。 1-3发子弹，每件视网膜可以出手。
- 墨盒和插入基因枪枪附加一个氦源。设置到110 psi的压力。
介质的制备
- 夹层介质
艾姆斯1瓶溶液（Sigma公司8.8克） 1.9通用碳酸氢钠 1毫升10％笔/链球菌/ L -谷氨酰胺（1:100）（GIBCO / Invitrogen公司） 第990笔资料ml蒸馏水至1L ------------------------------- 1公升 - 使用0.22微米的过滤器，过滤器的夹层介质。
- 孵化中期（500毫升）
485毫升，过滤夹层媒体 5毫升1％N2补充（GIBCO / Invitrogen公司） 10毫升1％马血清（Sigma公司） 500μL酚红 -------------------------------------------------- - 0.5升 - 使用0.22微米的过滤器，过滤器的孵化中期。
- 气泡直径2到视网膜收获协议开始前15分钟清扫中等。
制备视网膜孵化室
- 在油烟机，填补了60毫米深菜（孵化商会，NUNC），25毫升孵化中期。菜肴的数量取决于RET数量INAS需要。
- 每个深盘放入一个过滤器的立场。只有提示的立场非常不应该被淹没。
- 进入孵化器的所有深的菜，直到视网膜准备。
- 填写两个100毫米的培养皿中，并带来解剖台上。
兔眼视网膜的制备
- 牺牲一个根据既定协议的兔。下面没有引擎盖下进行。
- 角度剪刀，眼睛后方插入到兔子的眼窝，切割，贴在眼睛上膜和光学神经。
- 轻轻抬起眼睛，用含氧清扫媒体。
- 眼球切片以及眼睛（角膜朝上）放入，盖上盖子。
- 将刀片水平下盖子。在一个平滑的运动，画，整个眼睛切断角膜刀片，留下了一个眼罩。
- 使用镊子，取出视网膜从眼球切片机和它放到滤纸。
- 卸下夹紧切断视神经附近地区和滤纸上向后拉的玻璃体和镜头。重复几次，直到几乎所有的玻璃体被删除，眼罩看起来瘪了。
- 放入一个培养皿清扫媒体洗的眼罩。
- 切成所需件数（最多5件）的眼罩。
- 一件眼罩和它放在显微镜下。
- 使用镊子视网膜边缘钳巩膜和脉络膜掉以轻心。另一方面，使用细刷，刷脉络膜和视网膜之间。
- 使用短的，温和的议案，戏弄过视网膜脉络膜，直到它变得超然。
- 剪切关闭无菌移液管1英寸。使用此吸成一个培养皿中孵化中期洗的视网膜和地点。
- 使用1英寸的另一个无菌移液管切断，仔细转移Millicell小到0.4微米的过滤器（Millipore公司，卡特彼勒：PICMORG50）视网膜。
- 用刷子东方视网膜神经节细胞的一面朝上。
- 平展，轻轻刷上的视网膜边缘在视网膜上。最小感人的神经节细胞层用刷子尽可能。
- 用移液管过滤器删除多余的介质。
- 使用镊子，转移到修改后的suctioner的过滤器。 suctioner画从过滤器中删除所有的孵化中期的2-3倍。
视网膜基因喷补料和孵化
- 引擎盖下，放置到过滤站的视网膜含有过滤器在60毫米深菜（孵化室）。
- 确保介质过滤器底部的接触和介质不波及到视网膜上的过滤器两侧。过滤器应作为视网膜和媒体之间的接口。
- 拍摄每片视网膜两颗子弹。基因枪直接放在上面组织，约3-4厘米的距离。
- 放置到振动筛所有孵化商会在35 - 37℃培养箱中培养。
- 孵化中期，每天更换。视网膜可孵育最长为6天。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1。用这种方法，我能做些什么？
- 见细胞形态清晰。
- 标记细胞记录。
- 过度表达的蛋白质，像PSD95，而且其他蛋白质，调节细胞的反应，如离子通道，受体。
- 表达抑制RNA的。
2。成人视网膜，我可以保持多久？
- 4天是没有问题的成年兔。经过6天的细胞看“病”，即轴突回缩，你看到的树突和对光反应的记录肿胀变得不可靠（只〜50％的细胞被发现后，当时的光响应。
- 我们一直为2天小鼠视网膜。小鼠都比较困难，因为视网膜血管化，也比兔视网膜厚。
3。我如何确保在此时间后，你的视网膜是健康？
- 金标准是从他们录制。神经节细胞对光线作出反应。你应该从光保护您的组织中孵化，以避免漂白的感光色素，因为你已经解剖过的视网膜色素上皮细胞的孵化。
- 我们偶尔也用微电极阵列记录来测试我们的视网膜。
4。你为什么要操纵只有在几个月的时间在视网膜细胞呢？
- 有些问题不能得到解决，否则。例如一个神经节细胞上的GABA受体的考虑。你可以使用γ-氨基丁酸受体阻滞剂，但你会抑制GABA能在视网膜上的所有传输，而不是仅仅输入您感兴趣的单元格。它可以非常难以区分，在特定的细胞的效果，整体的“网络效应“对整个视网膜。
- 如果你想清楚地看到的形态，你不能标签的所有单元格，否则你只是得到一个烂摊子。
5。这是适合作为一个人口染色的方法吗？
- 号基因开枪是一个随机过程。你会得到许多神经节细胞，许多流离失所的无长突细胞，一些Muller细胞，和所有其他类型的细胞少得多。
6。是否有任何“招数”我要知道，使其工作？
- 不是真的。但重要的是你的视网膜剥离相对较快，所以你必须在不到30分钟的过滤器上您的片断。件不应太小，约1平方厘米是正常的。期望从一个兔眼3-4枚。
- 清扫工具要严格远离任何接触到与固定剂和其他烈性化学制品。
- 尝试设置您的孵化器35而不是37℃，使视网膜不会太热。
- 你不需要添加生长因子，如脑源性神经营养因子媒介，至少我们不这样做常规，但你应该使用氮气补充，1％马血清和抗生素。我们提供了所有的事情你和会作为一个补充文件，以本文档需要的列表。
7。你能为其他的东西，而不是基因枪质粒吗？
- 是的，我们用染料标记的右旋糖酐或DII和DIO。但是你可以使用钙指示染料，或几乎任何东西，你可以到金或钨子弹大衣。
8。有什么限制？
- 首先，时间。你必须切断视神经，这意味着神经节细胞最终会变质。这是没有问题的长达6天，但之后，我们将不信任任何的视网膜。现在，如果你只是想表达GFP或其他一些细胞填充标记，潜伏期2-3天就足够了，但在某些情况下，比如当你想表达的抑制RNA的，效果可以采取4天或以上表演。在这里，你必须牢记时间表。
9。其他研究人员的工作应做到心中有数呢？
- 在视网膜的领域，当然汪楚萍曾在华盛顿大学的实验室。还有人已在其他系统中，像海马切片准备，做了很多工作。我们不假装是能够提供全面的文献调查，但在引用列表中的文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K.
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
