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Biology

वयस्क खरगोश रेटिना के Organotypic संस्कृति

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Havard Medical School, MGH - Massachusetts General Hospital

Summary

यह आलेख विच्छेदन और खरगोश रेटिना और GFP या रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में subcellular मार्करों के एक किस्म एन्कोडिंग plasmids के कण मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के ऊष्मायन को दर्शाता है.

Abstract

कार्यात्मक तंत्रिका ऊतकों की Organotypic संस्कृति प्रणालियों neurobiological अनुसंधान में महत्वपूर्ण औजार हैं. आदर्श रूप में, एक ऐसी प्रणाली इमेजिंग तकनीक, आनुवंशिक हेरफेर, और electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ संगत होना चाहिए. यहाँ हम वयस्क खरगोश रेटिना है कि कोई विशेष उपकरण और बहुत कम रखरखाव की आवश्यकता है के लिए एक सरल interphase टिशू कल्चर प्रणाली मौजूद है. हम विच्छेदन और खरगोश रेटिना और GFP या रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में subcellular मार्करों के एक किस्म एन्कोडिंग plasmids के कण मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के ऊष्मायन प्रदर्शित करता है. खरगोश retinas सुसंस्कृत इस तरह जिंदा लिए समग्र शारीरिक संरचना के बहुत कम परिवर्तन या व्यक्ति की आकारिकी नाड़ीग्रन्थि और amacrine कोशिकाओं के साथ छह दिनों तक रखा जा सकता है.

Protocol

बनाना जीन बंदूक बुलेट (स्वर्ण)

  1. 100% EtOH में 100X PVP (0.5mg/ml) बनाओ.
  2. BioRad 1.6 माइक्रोन microcarrier सोने की 30mg वजन और यह एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में जगह.
  3. 0.5-3 μg प्लाज्मिड / मिलीग्राम सोने के एक एकाग्रता दे की जरूरत प्लाज्मिड की राशि की गणना, और ट्यूब में सोने microcarriers के साथ प्लाज्मिड जगह. कई plasmids कम्बाइन अगर जरूरत है.
  4. आसुत जल के साथ 100 μl प्लाज्मिड की मात्रा लाओ.
  5. ट्यूब में 0.05M spermidine के 100 μl जोड़ें. भंवर ट्यूब 30 सेकंड.
  6. भंवर पूर्ण गति से 1 मिनट. 3-5 मिनट के लिए Sonicate ..
  7. 15 मिनट के लिए एक Biorad PDS-1000/He तंत्र में Tefzel टयूबिंग की एक उचित लंबाई सूखी.
  8. Sonication के बाद पूरी गति से 1-2 मिनट के लिए, भंवर. ट्यूब जबकि vortexing खोला की अनुमति धीरे धीरे गति कम.
  9. ट्यूब ड्रॉप करने के लिए एम 1 2 धीरे धीरे CaCl 100 μl बुद्धिमान जोड़ें जबकि vortexing.
  10. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब छोड़ो.
  11. 5 माइक्रोन फिल्टर बनाओ.
    1. सुइयों के बिना दो 5ml सीरिंज ले लो.
    2. सवार निकालें, और काली टोपी अलग. छोटे कैंची ले रहा है, काला करने के लिए एक अंगूठी दे टोपी के एक भाग में कटौती. शुद्ध दो अंगूठियां अन्य सवार पर दोहराएँ.
    3. दो अंगूठियां के बीच 5 माइक्रोन (लघु पार्ट्स, इंक नायलॉन फिल्टर, आधा इंच व्यास) फिल्टर, और सिरिंज की नोक में सैंडविच धक्का सैंडविच.
    4. एक 50ml शंक्वाकार फ्लास्क पर लटकना सिरिंज.
  12. 10 मिनट के बाद, भंवर 30 सेकंड के लिए ट्यूब.
  13. 30 सेकंड के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र और गोली बचाने.
  14. 1ml 100% EtOH की गोली के लिए जोड़ें. विंदुक टिप का उपयोग करें गोली, और भंवर 30 सेकंड तोड़ने. 30 सेकंड स्पिन और EtOH हटायें. 2 अधिक बार दोहराएँ.
  15. गोली के लिए 100% EtOH के 1ml जोड़ें (टिप के साथ तोड़). 5 माइक्रोन फिल्टर में इस प्लेस और यह प्रवाह में 50ml शंक्वाकार ट्यूब के माध्यम से गंभीरता से. अधिक EtOH के रूप में बाहर धोने ट्यूब या के माध्यम से प्रवाह के साथ मदद की जरूरत का उपयोग करें.
  16. 2000rpm पर 5-10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में 50ml ट्यूब स्पिन. निकालें सतह पर तैरनेवाला, बचाने के गोली.
  17. जरूरत microcarriers के वांछित घनत्व पर निर्भर करता है, 800μl 1.5ml 100% EtOH और इसी 8 μl 15 μl PVP समाधान जोड़ने.
  18. भंवर और तुरंत Biorad PDS-1000/He तंत्र के लिए जाओ.
  19. Biorad PDS-1000/He उपकरण
    1. सुखाने ट्यूब N2 गैस टैंक को जोड़ने ट्यूब डिस्कनेक्ट
    2. बाहर ले जाओ मशीन से Tefzel टयूबिंग सुखाने
    3. 50ml शंक्वाकार ट्यूब में एक छोर डालें, और टयूबिंग के दूसरे छोर पर एक सिरिंज देते हैं. ट्यूब के बीच में भूरे रंग के घोल चूसो.
    4. मशीन में ट्यूबिंग वापस डालें.
    5. 4 मिनट के लिए रुको (रोटेशन बिना)
    6. 4 मिनट के बाद, बंद EtOH धीरे धीरे और ध्यान से चूसना, microcarriers को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित बनाने.
    7. 1 मिनट के लिए टयूबिंग घुमाएँ.
    8. 1 मिनट के बाद, सुखाने ट्यूब N 2 गैस की टंकी को जोड़ने ट्यूब कनेक्ट और टयूबिंग 15 मिनट के लिए सूखी.
  20. 15 मिनट के बाद, बुलेट आकार के टयूबिंग के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा या संग्रहीत एक exsiccator में 4 ° C में कटौती. बुलेट 3 महीने के लिए संग्रहीत कर सकते हैं.

जीन बंदूक की तैयारी

  1. एक कारतूस में रखें गोलियों. रेटिना के प्रत्येक टुकड़ा 1-3 गोलियों के साथ शॉट किया जा सकता है.
  2. जीन बंदूक में कारतूस डालें और एक हीलियम स्रोत के लिए बंदूक देते हैं. दबाव 110 साई के लिए सेट.

मीडिया की तैयारी

  1. विच्छेदन मध्यम

    1 बोतल एम्स समाधान (सिग्मा, 8.8g)
    1.9 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट
    10 मिलीलीटर 1% कलम / / strep (1:100) एल Glutamine (Gibco / Invitrogen)
    990 मिलीलीटर आसुत पानी 1L
    -------------------------------
    1 लीटर


  2. फ़िल्टर विच्छेदन मध्यम 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग.
  3. ऊष्मायन मध्यम (500ml)

    फ़िल्टर विच्छेदन मीडिया के 485 मिलीलीटर
    1% N2 पूरक के 5 मिलीलीटर (Gibco / Invitrogen)
    10ml 1% घोड़े सीरम (सिग्मा)
    Phenol के लाल के 500 μl
    -------------------------------------------------- -
    0.5 एल


  4. ऊष्मायन 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग मध्यम फ़िल्टर.
  5. बुलबुला रेटिना कटाई प्रोटोकॉल शुरुआत से पहले 15 मिनट के लिए विच्छेदन मध्यम में 2 हे .

रेटिना के लिए ऊष्मायन कक्षों की तैयारी

  1. एक डाकू के तहत, ऊष्मायन माध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ कई 60 मिमी गहरी व्यंजन (ऊष्मायन कक्षों, Nunc) भरें. व्यंजन की संख्या भिगोरना की संख्या पर निर्भर करता हैआई एन ए एस की जरूरत है.
  2. प्रत्येक गहरी डिश में एक फिल्टर खड़े रखें. केवल स्टैंड के बहुत सुझावों जलमग्न नहीं होना चाहिए.
  3. इनक्यूबेटर में सभी गहरी व्यंजन रखें जब तक retinas के लिए तैयार हैं.
  4. दो 100 मिमी पेट्री डिश भरें और विच्छेदन बेंच को लाने के लिए.

खरगोश रेटिना की तैयारी

  1. स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार एक खरगोश बलिदान. निम्नलिखित एक डाकू के तहत प्रदर्शन किया जा नहीं है.
  2. Angled कैंची के साथ, यह आंखों के पीछे खरगोश की थैली में, सम्मिलित झिल्ली और ऑप्टिकल तंत्रिका है कि आंख से जुड़े होते हैं काटने.
  3. धीरे बाहर आंख उठा और यह oxygenated विच्छेदन मीडिया के साथ धोने.
  4. एक आँख slicer के कुएँ में आंख (कॉर्निया सामना करना पड़ रहा) प्लेस और ढक्कन बंद करें.
  5. ढक्कन के तहत क्षैतिज सही ब्लेड रखें. एक निर्बाध गति में, आँख बंद कॉर्निया में कटौती भर में ब्लेड आकर्षित करने के लिए, एक आँख कप छोड़ने.
  6. संदंश का प्रयोग, आँख slicer से रेटिना में अच्छी तरह से हटाने और एक फिल्टर पेपर पर यह जगह.
  7. शीशे और कटे ऑप्टिक तंत्रिका के पास एक क्षेत्र और एक फिल्टर पेपर पर पीछे की ओर खींच clamping के द्वारा लेंस निकालें. कई बार दोहराएँ जब तक लगभग सभी शीशे निकाल दिया है और आंख कप पिचकाकर दिखता.
  8. प्लेस विच्छेदन मीडिया को धोने के साथ एक पेट्री डिश में आंख कप.
  9. टुकड़े की वांछित संख्या (5 टुकड़े अधिकतम) में आंख कप कट.
  10. आँख कप का एक टुकड़ा ले लो और खुर्दबीन के नीचे यह जगह.
  11. श्वेतपटल रंजित और संदंश का उपयोग रेटिना के किनारे पर हल्के से एक साथ दबाना है. दूसरे हाथ के साथ, एक ठीक ब्रश का उपयोग करें रंजित और रेटिना के बीच सही ब्रश.
  12. कम, कोमल गतियों का प्रयोग, रंजित बंद रेटिना तंग जब तक यह अलग हो जाता है.
  13. एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक बंद 1 इंच का कट. इस प्रयोग ऊष्मायन मध्यम धोने के लिए की एक पेट्री डिश में रेटिना और जगह चूसना.
  14. 1 इंच के साथ एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग काट, ध्यान से एक 0.4 सुक्ष्ममापी Millicell फिल्टर (Millipore, बिल्ली नहीं: PICMORG50) पर रेटिना हस्तांतरण.
  15. पूरबी रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल ऊपर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ एक ब्रश का उपयोग करें.
  16. रेटिना के किनारों पर हल्के brushing द्वारा रेटिना समतल. जितना संभव के रूप में में ब्रश के साथ नाड़ीग्रन्थि सेल परत छू न्यूनतम.
  17. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ फिल्टर पर अधिक मध्यम निकालें.
  18. संदंश का प्रयोग, एक संशोधित suctioner पर फ़िल्टर हस्तांतरण. Suctioner पर 2-3 बार फिल्टर से सभी ऊष्मायन मध्यम निकालने ड्रा.

जीन शिकार और रेटिना की ऊष्मायन

  1. एक डाकू के तहत, 60 मिमी गहरी व्यंजन (ऊष्मायन कक्षों) में फिल्टर खड़ा पर रेटिना युक्त फिल्टर के प्रत्येक जगह है.
  2. सुनिश्चित करें कि मध्यम और मध्यम रेटिना पर फिल्टर के पक्ष में फैल नहीं करता है कि फिल्टर के नीचे के साथ संपर्क में है. फिल्टर रेटिना और मध्यम के बीच एक अंतरफलक के रूप में कार्य करना चाहिए.
  3. दो गोलियों के साथ रेटिना के प्रत्येक टुकड़ा को गोली मारो. जीन ऊतक सीधे ऊपर बंदूक प्लेस, के बारे में 3-4 सेमी.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर - एक प्रकार के बरतन पर सभी 35 ऊष्मायन कक्षों में रखें.
  5. ऊष्मायन मध्यम हर दिन के साथ बदलें. रेटिना 6 दिनों की एक अधिकतम के लिए incubated जा सकता है.

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Discussion

1. मैं इस विधि के साथ क्या कर सकते हैं?

  • सेल आकारिकी स्पष्ट रूप से देखें.
  • लेबल करने के लिए उन से रिकॉर्ड कोशिकाओं.
  • Overexpress प्रोटीन PSD95 की तरह, लेकिन यह भी अन्य प्रोटीन है कि सेल प्रतिक्रिया मिलाना, जैसे आयन चैनल, रिसेप्टर्स.
  • निरोधात्मक RNAs एक्सप्रेस.

2. कब तक मैं वयस्क रेटिना रख सकते हैं?

  • 4 दिनों वयस्क खरगोश के लिए कोई समस्या नहीं है. छह दिनों के बाद कोशिकाओं को देखने के लिए "बीमार", यानी axons वापस लेना है, आप dendrites और प्रकाश प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की सूजन देख अविश्वसनीय हो जाता है (केवल ~ कोशिकाओं के 50% करने के लिए उस समय के बाद प्रकाश उत्तरदायी होना पाया गया.
  • हम 2 दिनों के लिए माउस retinas रखा. चूहे और अधिक कठिन हैं, क्योंकि retinas vascularized हैं, और भी खरगोश रेटिना की तुलना में मोटा.

3. मुझे यकीन है कि अपने रेटिना के इस समय के बाद स्वस्थ है कैसे कर सकता हूँ?

  • सोने के मानक से उन्हें रिकॉर्डिंग है. नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं अभी भी प्रकाश के लिए प्रतिक्रिया चाहिए. आप photopigment विरंजन से बचने के लिए ऊष्मायन के दौरान प्रकाश से अपने ऊतक की रक्षा करनी चाहिए क्योंकि आप वर्णक उपकला बंद ऊष्मायन के लिए रेटिना काटना है.
  • हम कभी कभी भी microelectrode सरणी रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल हमारे retinas परीक्षण.

4. आप केवल एक समय में एक कुछ कोशिकाओं रेटिना में हेरफेर करने के लिए क्यों चाहते हो?

  • कुछ सवालों अन्यथा संबोधित नहीं किया जा सकता है. उदाहरण के एक नाड़ीग्रन्थि सेल पर GABA रिसेप्टर्स के लिए पर विचार करें. आप GABA ब्लॉकर्स का उपयोग कर सकता है, लेकिन आप रेटिना में सभी GABAergic संचरण को बाधित, कक्ष आप रुचि रखते हैं अंदर यह बहुत विशेष रूप में है कि सेल पर एक प्रभाव के बीच भेद करना मुश्किल है, और समग्र "नेटवर्क प्रभाव किया जा सकता है बस इनपुट नहीं "पूरे रेटिना पर.
  • यदि आप आकारिकी स्पष्ट रूप से देखने के लिए चाहते हैं, तो आप सभी कोशिकाओं नहीं लेबल कर सकते हैं, नहीं तो तुम सिर्फ एक गड़बड़ हो.

5. इस विधि उपयुक्त है के रूप में एक जनसंख्या दाग?

  • सं जीन शिकार एक यादृच्छिक प्रक्रिया है. आप कई नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, कई विस्थापित amacrine कोशिकाओं, कुछ मुलर कोशिकाओं, और अन्य सभी प्रकार के सेल काफी कम मिलेगा.

6. वहाँ किसी भी "चाल" मैं यह काम करने के लिए पता है?

  • सच में नहीं. लेकिन यह जरूरी है कि आप रेटिना के विच्छेदन अपेक्षाकृत जल्दी है, तो आप कम से कम 30 मिनट में फिल्टर पर अपने टुकड़े है. टुकड़े बहुत छोटा नहीं हो सकता है, एक वर्ग सेंटीमीटर के बारे में ठीक है. एक खरगोश की आँख से 3-4 टुकड़े की अपेक्षा करें.
  • अपने विच्छेदन उपकरण कड़ाई से कुछ भी है कि fixatives और अन्य कठोर रसायनों के साथ संपर्क में आता है से दूर रखो.
  • अपने इनक्यूबेटर की स्थापना 37 के बजाय 35 सी की कोशिश करो, तो रेटिना हो जाता है बहुत गर्म नहीं है.
  • आप BDNF की तरह अपने माध्यम से वृद्धि कारकों को जोड़ने की जरूरत नहीं है, कम से कम हम यह नियमित नहीं करते, लेकिन आप N2 पूरक, 1% घोड़े सीरम, और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करना चाहिए. हम सब बातें तुम 'और इस दस्तावेज़ीकरण के लिए एक अनुपूरक फ़ाइल के रूप में की आवश्यकता होगी की एक सूची प्रदान करते हैं.

7. आप जीन बंदूक अन्य सामान, बजाय plasmids सकते हैं?

  • हाँ, हम डाई संयुग्मित dextrans या DiI और डियो का इस्तेमाल किया है. लेकिन आप कैल्शियम सूचक रंगों का उपयोग करें, सकता है या बहुत ज्यादा कुछ भी आप सोने या टंगस्टन गोलियों पर कोट कर सकते हैं.

8. सीमाएं हैं?

  • सबसे पहले, समय. आप ऑप्टिक तंत्रिका है, जिसका अर्थ है कि नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं अंततः पतित जाएगा कटौती की है. यह 6 दिनों के लिए एक समस्या नहीं है, लेकिन उसके बाद हम retinas के किसी भी अधिक विश्वास नहीं होता. अब, अगर तुम सिर्फ GFP या व्यक्त करना चाहता हूँ कुछ अन्य सेल भरने मार्कर, 2-3 दिनों के ऊष्मायन पर्याप्त है, लेकिन कुछ मामलों में, जब आप निरोधात्मक RNAs व्यक्त करना चाहता हूँ की तरह 4 या अधिक दिनों के प्रभाव लेने के लिए कर सकते हैं दिखाने के लिए. यहाँ, आप के मन में समयरेखा रखने के है.

9. क्या एक अन्य शोधकर्ता के काम के बारे में पता होना चाहिए?

  • रेटिना के क्षेत्र में, निश्चित रूप से वाशिंगटन विश्वविद्यालय में राहेल वाँग प्रयोगशाला. वहाँ भी लोगों हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी जैसे अन्य प्रणालियों में किया है काम का एक बहुत है. हम साहित्य की एक पूर्ण सर्वेक्षण देने के लिए सक्षम होना बहाना नहीं, लेकिन संदर्भ सूची में कागजात की जाँच करें.

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Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina. J. Vis. Exp. (3), e190, doi:10.3791/190 (2007).

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