Biology

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

Published: April 29, 2010 doi: 10.3791/1919

¹Howard Hughes Medical Institute, Rockefeller University

Summary

גורלו של replisome הבאה התנגשות עם ראש על RNA פולימראז (RNAP) אינו ידוע. אנו מוצאים כי הדוכנים replisome על התנגשות עם RNAP חזיתית, אך קורות חיים התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. MFD מקדמת מחדש שכפול ידי הקלת עקירה של RNAP לאחר ההתנגשות.

Abstract

בשנת vivo מחקרים מראים כי מזלגות שכפול נעצרים עקב מפגשים עם חזיתית מתחמי שעתוק. עם זאת, גורלם של replisome ו RNA פולימראז (RNAP) בעקבות התנגשות חזיתית אינו ידוע. כאן, אנו מוצאים כי ה coli דוכני replisome על התנגשות עם הראש על מורכבות שעתוק, אבל במקום לקרוס, מזלג שכפול נשאר יציב מאוד, ובסופו של דבר יתחדש התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. כמו כן, אנו מוצאים כי גורם שעתוק תיקון צימוד, MFD, מקדם מחדש ישירה של המזלג בעקבות התנגשות ידי הקלת עקירה של RNAP. ממצאים אלה מעידים על היציבות הפנימית של מנגנון השכפול ואת תפקיד הרומן מסלול שעתוק מצמידים את התיקון בקידום שכפול בעבר לחסום RNAP.

Protocol

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו פומרנץ ו או 'דונל, המדע 327, 590-592 (2010) .

1. האסיפה של קומפלקס נעצרה התארכות RNAP בוצעה כדלהלן:

500 nM הריכוז הסופי של ה RNAP coli σ ⁷⁰ הוא היה מעורבב עם ריכוז 5 nM הסופי של תבנית biotinylated kb 3.6-DNA המכיל את האמרגן T7A1 ב μl 100 של המאגר (20 טריס Cl-(pH 7.5), 8 מ"מ MgCl _2, 0.5 מ"מ mM EDTA, 5 mM DTT, גליצרול 10%) במשך 10 דקות על 37 ° C. 100 מיקרומטר של APU ו -40 מיקרומטר אחד GTP, ATP ו CTP נוספו 10 דקות נוספות ב 37 ° C.

2. Immobilization של מורכבות נעצרה התארכות RNAP על חרוזים streptavidin בוצעה כדלהלן:

200 μl של חרוזים מצופים streptavidin מגנטית (Invitrogen) נוספו התגובה מעל 10 דקות בכל מקום זמני.

3. טיהור המורכב משותקת נעצרה התארכות RNAP בוצעה כדלהלן:

החרוזים (מלמעלה) נשטפו 5 פעמים עם 0.9 מ"ל של המאגר מכיל 0.75 M NaCl, 200 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ssDNA (supernatant הוסר לאחר כל שלב לשטוף על ידי הפרדה מגנטי.) הבא, חרוזים נשטפו 2 פעמים עם 0.9 מ"ל של חיץ א

4. כינונה של מזלג שכפול יחסית במורד הראש על RNAP בוצעה כדלהלן:

חרוזים (מלמעלה) היו resuspended ב μl 100 של ניו אינגלנד Biolabs חיץ 4 ו - 10 יחידות של סאפ אני (ניו אינגלנד Biolabs) נוספה על 10 דקות בשעה 37 ° C. החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 0.9 מ"ל של המאגר ואת resuspended אז μl 50 של המאגר תגובה מהירה קשירת T4 (ניו אינגלנד Biolabs). 2 μl של האנזים T4 מהירה (ניו אינגלנד Biolabs) נוספה יחד עם ריכוז 6 nM הסופי של ה-DNA מראש annealed מפוצל (RP10, RP22, RP25) במשך 10 דקות בכל מקום זמני. החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 0.9 מ"ל של חיץ א

5. האסיפה של replisome ועל ייזום סינתזה של גדיל מוביל מזלג שכפול בוצעה כדלהלן:

448 pmol של DnaB (כמו hexamer) הודגר עם μl 150 חרוזי חיץ (20 mM טריס Cl-(pH 7.5), 8 מ"מ MgCl _2, 0.5 mM EDTA, 5 מ"מ DTT, גליצרול 10%) במשך של 30 ב 23 ° C. 4.9 pmol של Pol III * (Pol III HE מינוס β), 15 pmol של β, 2 mM ATP, ו - 60 מיקרומטר אחד dGTP ו dATP נוספו בהיקף של μl 200 ו מודגרות עוד 5 דקות על 37 ° C. שכפול יזם על הוספת 10 מיקרוגרם SSB ו - 24 מיקרומטר אחד dATP ו dTTP יחד עם ^[α-32-P] dTTP ו ^[α-32-P] dCTP (פעילות ספציפית, 3,000-5,000 עותקים לדקה / pmol) נפח סופי של 250 μL. תגובות הופסקה אחרי 10 דקות על הוספת 12 μl של 500 mM EDTA.

6. טיהור וריכוז של רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA בוצע כדלקמן:

החרוזים (מלמעלה) היו מבושלים לאחר התגובה הופסקה על מנת להסיר את ה-DNA מן החרוזים. ה-DNA כל שיורית שנותרה המחוברים חרוזים הוסר על ידי טיפול עם חרוזים proteinase K בנפח של ul 10 למשך 30 דקות ב 50 ° C. החרוזים היו מבושלים אז supernatant הוסר על ידי הפרדה מגנטי. Supernatant משולב הכולל את ה-DNA היה מטוהרים באמצעות PCR Qiagen ערכת ניקוי. מטוהרים רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA נותחו לאחר מכן ג'ל agarose אלקליין.

* שכפול בהעדר חזיתית RNAP נעצרה מורכב התארכות בוצעה כאמור לעיל, עם זאת, σ ⁷⁰ הושמט.

נציג תוצאות:

התנגשות של replisome עם ראש על RNAP בדרך כלל התוצאות בשני מוצרים של 2.5 קילו ו 3.6 קילו אורך. המוצר 2.5 kb מייצג את האורך של ה-DNA של מזלג כדי RNAP נעצרה תוצאות replisome השתהות על התנגשות עם RNAP. המוצר 3.6 kb מייצגים באורך מלא דנ"א תוצאות תפוסה או חלקית של האמרגן על ידי RNAP או חלקית replisome לקריאה דרך של RNAP חזיתית. תוצאה טובה או מדויק מוכיח כי כ -50% באורך מלא DNA מיוצר. עם זאת, במקרים מסוימים פחות תפוסה של האמרגן על ידי RNAP מתרחשת אחוז גבוה יותר של דנ"א באורך מלא, הוא ציין כי אוכלוסייה גדולה יותר של replisomes לא נתקלים RNAP חזיתית. שכפול בהעדר תוצאות RNAP נעצרה ב-DNA באורך מלא בלבד (3.6 kb).

איור 1
איור. 1 replisome היא הקשתה על ידי חזיתית RNAP.
(א) התקנה ניסיונית. E. colאני RNAP מורכב התארכות נעצרה הורכב על ה-DNA המכיל את האמרגן biotinylated T7A1 כפי שתואר לעיל (9). בקצרה, קומפלקס התארכות נעצרה הוקמה 20 bps במורד הזרם האמרגן על ידי דוגרים holoenzyme RNAP עם DNA biotinylated עבור 10 דקות לאחר מכן על ידי תוספת של APU, GTP, ATP ו CTP 10 דקות נוספות. חרוזים streptavidin נוספו 10 דקות נוספות ואז חרוזים נשטפו חמש פעמים עם 0.9 מ"ל של מאגר המכיל 0.75M NaCl, 200 מ"ג / מ"ל הפרין, ו 100 ננומטר גדיל DNA בודד להסיר יציב RNAP-DNA תסביכים NTPs עודף . ה-DNA היה מעוכל לאחר מכן עם SAPI, התרחצתי, ligated ל-DNA מראש annealed מפוצל. החרוזים נשטפו שוב לפני הרכבה של replisome. האמרגן ממוקם 2.5 KB מתוך המזלג מכוונת אל תעתיק ישיר לכיוון המזלג. (ב) DnaB נוספה אז replisome הורכב ושכפול יזם או בנוכחות (מסלול 2) או היעדרות (מסלול 1) של חזיתית RNAP.

Disclosures

כביסה המורכב התארכות נעצרה מאוגדים חרוזים עם מלח גבוהה היא קריטית על מנת להסיר כל אי - יציבות או דווקא מולקולות RNAP כבול. RNAP יש זיקה גבוהה ביותר עבור פריימר-תבנית ה-DNA מבנים סוג. לפיכך, יש צורך להסיר כאלה שאינם ספציפיים RNAP-DNA מתחמי מנת לבצע שכפול מתבנית-פריימר. ריכוז רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA באמצעות PCR Qiagen ערכת טיהור חיוני גם כדי לקבל אות גבוה מספיק רדיואקטיבי כי ניתן לצפות הג'ל.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה במיוחד סת Darst לאספקת חלבונים RNAP ו MFD ו וקטורים הביטוי. אנחנו גם להודות סרגיי Borukhov למתן גרב ודן אנג לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (MOD) ועל ידי מארי Josee והנרי Kravis מלגה באוניברסיטת רוקפלר (RTP).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads M-270	Invitrogen	653.05
SapI	New England Biolabs	R0569S
T4 Quick Ligase	New England Biolabs	M2200S
PCR Purification Kit	Qiagen	28104