Summary
Het lot van de replisome na een botsing met een head-on RNA-polymerase (RNAP) is onbekend. We vinden dat de replisome kraampjes bij botsing met een head-on RNAP, maar rek hervat na het verplaatsen van de RNAP uit DNA. MFD bevordert replicatie opnieuw op te starten door het vergemakkelijken van verplaatsing van de RNAP na de botsing.
Abstract
In vivo studies suggereren dat replicatie vorken zijn gearresteerd te wijten aan ontmoetingen met het hoofd-on transcriptie complexen. Toch is het lot van de replisome-en RNA-polymerase (RNAP) na een frontale botsing is onbekend. Hier vinden we dat de E. coli replisome kramen op botsing met een head-on transcriptie complex, maar in plaats van storten, de replicatie vork blijft zeer stabiel en uiteindelijk hervat rek na het verplaatsen van de RNAP uit DNA. We vinden ook dat de transcriptie-reparatie koppeling factor, MFD, directe herstart van de vork na de botsing door het vergemakkelijken van verplaatsing van de RNAP bevordert. Deze bevindingen tonen de intrinsieke stabiliteit van de replicatie apparatuur en een nieuwe rol voor de transcriptie-gekoppelde reparatie route in het bevorderen van replicatie verleden een RNAP blok.
Protocol
Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Pomerantz en O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) .
1. Montage van een stil RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd:
500 nM uiteindelijke concentratie van E. coli RNAP σ 70 HE werd gemengd met 5 nM uiteindelijke concentratie van een gebiotinyleerd 3,6 kb DNA-template met daarin de T7A1 promoter in 100 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 10 min bij 37 ° C. 100 pM van de APU en 40 uM elk van GTP, ATP, en CTP werden toegevoegd voor een extra 10 min bij 37 ° C.
2. Immobilisatie van het gestopt RNAP rek complex op streptavidine parels werd als volgt uitgevoerd:
200 ul van streptavidine magnetische gecoate kralen (Invitrogen) werden toegevoegd aan de reactie hierboven voor 10 min bij kamertemperatuur.
3. Zuivering van het geïmmobiliseerde gestopt RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd:
De kralen (van boven) werden gewassen 5 keer met 0,9 ml buffer A met 0,75 M NaCl, 200 ug / ml heparine en 20 microgram / ml ssDNA (Het supernatant werd verwijderd na elke wasbeurt stap voor magnetische scheiding.) Vervolgens wordt het bolletjes werden gewassen 2 keer met 0,9 ml buffer A.
4. Vorming van een replicatie vork stroomafwaarts ten opzichte van de kop-op RNAP werd als volgt uitgevoerd:
De kralen (van boven) werden geresuspendeerd in 100 pi van de New England Biolabs buffer 4 en 10 eenheden van Sap I (New England Biolabs) werd toegevoegd gedurende 10 min bij 37 ° C. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A en vervolgens geresuspendeerd in 50 ui van Quick T4 ligatiereactie buffer (New England Biolabs). 2 pi van Quick T4 ligase (New England Biolabs) werd toegevoegd, samen met 6 nM uiteindelijke concentratie van de pre-gegloeid gevorkte DNA (RP10, RP22, RP25) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A.
5. Vergadering van de replisome en de inleiding van de leidende streng synthese bij de replicatie vork werd als volgt uitgevoerd:
448 pmol van DnaB (zoals hexameer) werd geïncubeerd met de kralen 150 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 30 s bij 23 ° C. 4,9 pmol van Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol van β, 2 mM ATP, en 60 uM elk van dGTP en dATP werden toegevoegd tot een volume van 200 ul en geïncubeerd nog eens 5 min op 37 ° C. Replicatie werd gestart op het toevoegen van 10 microgram SSB en 24 pM elk van dATP en dTTP, samen met [α-32 P] dTTP en [α-32 P] dCTP (specifieke activiteit, 3,000-5,000 cpm / pmol) tot een eindvolume van 250 pi. Reacties waren beëindigd na 10 min op het toevoegen van 12 pi van 500 mM EDTA.
6. Zuivering en concentratie van de radio-gelabelde DNA-producten werd als volgt uitgevoerd:
De kralen (van boven) werden gekookt na de reactie werd beëindigd om het DNA te verwijderen uit de kralen. Eventueel resterende DNA dat aan de kralen werd verwijderd door de behandeling van de korrels met proteinase K in een volume van 10 ul gedurende 30 minuten bij 50 ° C. De parels werden dan gekookt en het supernatant werd verwijderd door middel van magnetische scheiding. De gecombineerde supernatant met het DNA werd gezuiverd met behulp van de PCR Qiagen Cleanup kit. Gezuiverd radio-gelabelde DNA-producten werden vervolgens geanalyseerd in een alkalisch agarose gel.
* Replicatie in de afwezigheid van een head-on RNAP gestopt verlenging complex werd uitgevoerd zoals hierboven, echter, σ 70 werd weggelaten.
Representatieve resultaten:
Botsing van de replisome met een kop-on RNAP resulteert meestal in twee producten van 2,5 kb en 3,6 kb in lengte. Het 2,5 kb product vertegenwoordigt de lengte van het DNA van de vork aan de RNAP gestopt en de resultaten van replisome stalling bij botsing met de RNAP. Het 3,6 kb product vertegenwoordigen full-length DNA en de resultaten van beide onvolledige bezetting van de promotor door RNAP of gedeeltelijke replisome lezen-through van het hoofd-on RNAP. Een goede of een nauwkeurig resultaat toont aan dat ongeveer 50% full-length DNA wordt geproduceerd. Echter, in sommige gevallen minder bezetting van de promotor door RNAP optreedt en een hoger percentage van de volledige lengte DNA wordt waargenomen, omdat een grotere bevolking van replisomes niet geconfronteerd met een head-on RNAP. Replicatie in de afwezigheid van een stilstand RNAP resulteert in enige full-length DNA (3,6 kb).
Figuur. 1 De replisome is belemmerd door een head-on RNAP.
(A) Experimentele opstelling. Een E. coli RNAP gestopt rek complex was gemonteerd op een gebiotinyleerde DNA dat de T7A1 promoter zoals eerder beschreven (9). In het kort, was een stil rek complex gevormd 20 basispunten stroomafwaarts van de promoter door incuberen RNAP holoenzyme met gebiotinyleerd DNA gedurende 10 minuten, gevolgd door de toevoeging van Apu, GTP, ATP, en CTP voor nog eens 10 minuten. Streptavidine kralen werden toegevoegd voor een extra 10 minuten toen de bolletjes werden vijf keer gewassen met elk 0,9 ml van de buffer die 0,75 NaCl, 200 mg / ml heparine, en 100 nM enkelstrengs DNA tot instabiele RNAP-DNA complexen en overtollige NTP's te verwijderen . Het DNA werd vervolgens gedigereerd met Sapi, gewassen, en geligeerd aan een pre-uitgegloeid gevorkte DNA. De kralen werden weer voor gewassen om de montage van de replisome. De promotor ligt op 2,5 kb van de vork en is gericht op directe transcriptie de richting van de vork. (B) DnaB werd toegevoegd toen de replisome werd samengesteld en replicatie werd ofwel ingewijd in de aanwezigheid (laan 2) of afwezigheid (baan 1) van een head-on RNAP.
Disclosures
Wassen van het gestopte rek complex gebonden aan de kralen met een hoog zoutgehalte is van cruciaal belang om eventuele instabiele of niet-specifiek gebonden RNAP moleculen te verwijderen. RNAP heeft een zeer hoge affiniteit voor primer-template type DNA-structuren. Zo is het noodzakelijk om dergelijke niet-specifieke RNAP-DNA complexen verwijderen om replicatie uit te voeren vanaf de primer-template. Het concentreren van de radio-gelabelde DNA-producten met behulp van de Qiagen PCR zuivering kit is ook van cruciaal belang voor het verkrijgen van een voldoende hoog radioactief signaal dat kan worden waargenomen in de gel.
Acknowledgments
We zijn vooral dankbaar voor het verstrekken van Seth Darst RNAP en MFD eiwitten en expressievectoren. We zijn ook bedanken Sergei Borukhov voor het verstrekken van Greb en Dan Zhang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (MOD) en door een Marie-Josee en Henry Kravis Fellowship aan de Rockefeller University (RTP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M-270 | Invitrogen | 653.05 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569S | |
| T4 Quick Ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
- Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
- Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
- McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
- Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
- Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
- Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
- Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
- Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
- Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
- Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
- Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
- Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
- George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).
