Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH ₅₀) Atividade de soro

Summary

A via clássica é ativada por anticorpos e culmina com a lise das células alvo. O CH

Abstract

O sistema complemento é um grupo de proteínas que, quando ativado levar a meta a lise das células e facilita a fagocitose através opsonisation. Componentes do complemento individual pode ser quantificado no entanto, este não fornece qualquer informação sobre a atividade da via. O CH

Protocol

Preparação de Saline Veronal 5x Buffered (VBS)

1. Para preparar a solução salina Veronal Buffered (VBS), três soluções distintas precisa estar preparado.
2. Prepare uma solução através da dissolução de NaCl e 21.25gm 0.94gm de Barbitone de sódio em 350ml de água destilada. A concentração final de NaCl e de sódio Barbitone são 1,02 e 13mm, respectivamente.
3. Prepare a solução 2, dissolvendo 1.44gm de Barbitone em 125ml de água destilada quente. A concentração final de Barbitone é 62,5 mm.
4. Prepare a solução 3 dissolvendo 20.33gm de MgCl ₂ e 4.41gm de CaCl ₂ em 100ml de água destilada. A concentração final de MgCl ₂ e CaCl ₂ é 2.18m e 440mm, respectivamente.
5. Mix de soluções 1 e 2 e arrefecer à temperatura ambiente.
6. Uma vez que a solução combinada tenha arrefecido, adicione 1.25ml de solução 3 e ajustar o pH a 7,3-7,5 usando HCl 1M.
7. Ajustar o volume final de 500ml com água destilada para preparar uma solução estoque de 5x.
8. Para preparar uma solução 1x de trabalho, diluir a 1:05 estoque com água destilada.

Sensibilização de hemácias de carneiro com hemolisina

1. Prepare a hemolisina, em primeiro lugar diluição 1:50 com VBS
2. Para adicionar 4ml de SRBC 6ml de VBS e misture delicadamente por inversão
3. Centrifugar a 600g x 5 minutos
4. Desprezar o sobrenadante e lavar as células mais 2 vezes
5. Após a lavagem final, centrifugar as células de 900g x 5 minutos para arrumar as células
6. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em VBS suficiente para preparar uma solução de 10% ou seja, 0,5 ml de hemácias são ressuspenso em 5 ml de tampão
7. Gotas adicionar igual volume de hemolisina (coelho anti-ovelha anticorpos de glóbulos vermelhos) para as células enquanto agita continuamente
8. Incubar a 30 ° C por 30 minutos em banho-maria
9. Misture suavemente as células a cada 15 minutos
10. SRBC sensibilizados podem ser armazenados durante a noite a 4 ° C

CH ₅₀ ensaio

1. Rotular uma série de tubos em duplicata com 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 e 1:128.
2. Prepare uma série de duas diluições de controle e soro em cada VBS em duplicado
3. Início às 01:04 (100ml + 300ml de soro VBS) e transferência de 200ml de amostra dentro do tubo próxima rotulados.
4. Misturar bem entre diluições e 200ml de transferência para a diluição seguinte com uma ponteira de pipeta nova.
5. Repita até que todos os cinco diluições são feitas.
6. Descartar 200ml da diluição 1:128 final.
7. Adicione 200 ml de suspensão SRBC sensibilizados para todos os tubos.
8. Identifique dois tubos separados como em branco e adicionar 200ml de sensibilizados SRBC + 200ml VBS. Estes tubos medirá lise espontânea do SRBC na VBS.
9. Rótulo mais dois tubos separados como lise TOTAL e adicionar 200ml de água + 200ml SRBC sensibilizados destilada.
10. Misture suavemente todos os tubos.
11. Incubar a 37 ° C por 30 minutos em banho-maria misturando após 15 minutos.
12. Centrifugar as amostras a 1.500 g por 5 minutos para sedimentar as hemácias.
13. Transferência de 100ml do sobrenadante de cada tubo para um bem em uma placa inferior 96 bem plana.
14. Adicione 100 ml de água destilada para cada poço.
15. Ler a absorbância das amostras em 540 nm usando um espectrofotômetro de placas.

Cálculos

1. Calcular a média de absorbância para cada amostra
2. Subtrair a absorbância BLANK (lise espontânea) de todas as amostras
3. Calcular a lise% para cada diluição com a seguinte fórmula:
   
4. Plotar a porcentagem de lise (eixo vertical) versus a diluição de soro no eixo horizontal.
5. Calcular a diluição necessária para a hemólise 50% para o controle e soro de ensaio (Fig. 2).

Resultados representativos:

O vídeo inclui um exemplo de resultados representativos. Na prática, um soro de controlo também é executado ao mesmo tempo, como o soro de teste e é tratado da mesma maneira. Abaixo (Tabela 1) são os dados da amostra a partir de uma amostra testada soro. Os dados são manipulados de acordo com a equação apresentada em 5.3.

Amostra	OD 540	Média
Em branco	0,042, 0,044	0,043
Lise total	0,183, 0,183	0,183
Diluição	OD 540	Média	Dizer-Blank	Lise%
01:08	0,200, 0,219	0,210	0,168	116
01:16	0,179, 0,173	0,176	0,134	93
01:32	0,134, 0,110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0,044, 0,045	0,045	0,003	2

Figura 1. Ativação da via clássica do complemento. A via clássica é ativada pela ligação imunoglobulina M (IgM) ou imunoglobulina g (IgG) na superfície de uma célula-alvo. A porção Fc da Ab liga a C1q, C1r é ativado e este por sua vez ativa outra molécula de C1r que, juntos, ativar duas moléculas de C1s. C1s agora cliva C4 que expõe o sítio de ligação para C2 que também é clivada. A ligação do C4b e C2a leva à formação de um complexo chamado de C3 convertase. Este complexo cliva C3 formando agora C3a e C3b, alguns dos quais combinam com o C3 convertase formando uma convertase C5. Este complexo age agora em C5, com a resultante C5b ligação com C6 iniciando a formação do complexo de ataque à membrana (MAC). C5b6 atua em C7, que por sua vez funcionam em C8 e C9 em última análise, resultando na formação do MAC final. (Goldsby et al, 2003).

Figura 2. Plotagem de dados de amostra e cálculo do CH50 para um controle e amostra de soro. (A), a percentagem calculada (%) lise de tanto o controle (•) e teste () amostras de soro são plotados contra o fator de diluição. (B) Para calcular a lise de 50%, uma linha é desenhada a partir do valor percentual de 50% até se cruza com as linhas do gráfico e, em seguida, uma linha vertical é traçada até a diluição. Neste exemplo, uma diluição de 35 vezes, do controle e 21,6 vezes diluição do soro de teste são necessários para alcançar a lise de 50%. Estes dados indicam que há menos complemento presente no soro de teste em relação ao controle, uma vez que necessitou de menos de diluição, antes de lise de 50% foi alcançado. A amostra de controlo também mostra lise> 100% na diluição de 1:08. Isto é provavelmente devido a lise incompleta do SRBC pela água destilada e mais eficiente lise pelos componentes do complemento.

Discussion

O CH ₅₀ ensaio está sujeito a muitas interferências. Alguns SRBC são mais frágeis do que outros, resultando em hemólise espontânea que não está relacionado para complementar a atividade. A afinidade do anticorpo de coelho varia de lote para lote e de um fabricante para outro, o que afeta a quantidade de anticorpo que se liga ao SRBC. Além disso, o processo de sensibilização SRBC com resultados de anticorpos em células com diferentes quantidades de anticorpos do revestimento SRBC. Coleta e armazenamento são uma importante fonte potencial de erro. Por exemplo, componentes do complemento C1q, C3, C4 e C5 são extremamente lábil, manipulação de amostra de forma adequada é fundamental. Exposição prolongada ao calor vai diminuir a atividade complementar e irá produzir fragmentos inativos de componentes do complemento. Para detectar todas as fontes de erro possível, é fundamental para testar um soro controle com um valor conhecido CH ₅₀ cada vez que o ensaio é realizado e para reproduzir o valor aceito do controle conhecido soro. Uma maneira de determinar se existem diferenças entre os diferentes lotes de SRBC e hemolisina é testar materiais novo teste contra uma amostra padrão de soro várias vezes e, então, determinar se existem alterações no nível basal de hemólise ou no CH ₅₀ valor para o soro de controlo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator