Summary
शास्त्रीय मार्ग एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय है और लक्ष्य कक्ष lysis में खत्म. दर्पण
Abstract
प्रणाली पूरक प्रोटीन के एक समूह है कि जब सक्रिय सेल lysis लक्ष्य के लिए नेतृत्व और opsonisation माध्यम phagocytosis सुविधा है. व्यक्तिगत पूरक घटक मात्रा निर्धारित हो सकता है लेकिन इस मार्ग की गतिविधि के रूप में किसी भी जानकारी प्रदान नहीं करता है सकते हैं. दर्पण
Protocol
5x Veronal buffered खारा (VBS) की तैयारी
- Veronal buffered खारा (VBS) तैयार करने के लिए, तीन अलग अलग समाधान करने के लिए तैयार रहने की जरूरत है.
- आसुत पानी की 350ml में NaCl और सोडियम Barbitone के 0.94gm 21.25gm भंग द्वारा तैयार समाधान 1. NaCl और सोडियम Barbitone के अंतिम सांद्रता 1.02M और 13mm क्रमशः रहे हैं.
- 2 गर्म आसुत पानी की 125ml में Barbitone के 1.44gm भंग करके समाधान तैयार करें. Barbitone के अंतिम एकाग्रता 62.5mM है.
- आसुत पानी की 100ml में 2 MgCl और CaCl 2 के 4.41gm 20.33gm भंग से 3 समाधान तैयार करें. 2 MgCl और CaCl 2 के अंतिम एकाग्रता 2.18M और 440mM क्रमशः है.
- मिक्स 1 और 2 समाधान और कमरे के तापमान शांत करने के लिए.
- एक बार संयुक्त समाधान ठंडा है, 3 समाधान के 1.25ml जोड़ने और पीएच 7.3-7.5 1M एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित.
- आसुत जल के साथ 500ml के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करने के लिए एक 5x शेयर समाधान तैयार है.
- एक 1x काम कर समाधान तैयार करने के लिए, आसुत जल के साथ शेयर 01:05 पतला.
भेड़ haemolysin के साथ लाल रक्त कोशिकाओं की Sensitisation
- सबसे पहले यह VBS साथ 1:50 गिराए haemolysin तैयार
- वी बी एस के SRBC के 4ml 6ml जोड़ने और धीरे उलटा द्वारा मिश्रण
- 600g 5minutes एक्स पर अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं को एक और 2 बार धो
- अंतिम धोने के बाद, 900g x 5minutes में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र करने के लिए कोशिकाओं पैक
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पर्याप्त VBS में कोशिकाओं resuspend पैक कोशिकाओं के एक 10% समाधान यानी 0.5ml तैयार बफर के 5 मिलीलीटर में resuspended
- कोशिकाओं को haemolysin (खरगोश विरोधी भेड़ लाल रक्त कोशिका एंटीबॉडी) की एक समान मात्रा जोड़ने जबकि लगातार घूमता Dropwise
- एक पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 30 ° C पर सेते
- धीरे कोशिकाओं हर 15minutes मिश्रण
- Sensitised SRBC 4 में रात भर संग्रहीत कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस
50 परख दर्पण
- 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 और 1:128 के साथ दो प्रतियों में ट्यूब की एक श्रृंखला के लेबल.
- दो प्रतियों में VBS में प्रत्येक परीक्षण सीरम नियंत्रण के दो गुना धारावाहिक dilutions की एक श्रृंखला तैयार
- 01:04 (100ml सीरम + 300ml VBS) में प्रारंभ और अगले लेबल ट्यूब में नमूने के 200ml हस्तांतरण.
- Dilutions और हस्तांतरण 200ml के बीच अच्छी तरह से एक ताजा विंदुक टिप के साथ अगले कमजोर पड़ने मिक्स.
- दोहराएँ जब तक सभी पांच dilutions बना रहे हैं.
- अंतिम 1:128 कमजोर पड़ने से 200ml त्यागें.
- सभी ट्यूबों निलंबित अवगत SRBC के 200ml जोड़ें.
- लेबल दो अलग ट्यूबों के रूप में खाली और अवगत SRBC + 200ml VBS 200ml जोड़ने. इन ट्यूबों VBS में SRBC की सहज lysis उपाय करेंगे.
- TOTAL lysis के रूप में एक और दो अलग अलग ट्यूबों लेबल और अवगत SRBC + 200ml आसुत पानी की 200ml जोड़ने.
- धीरे सभी ट्यूबों मिश्रण.
- ° 37 पर एक 15 मिनट के बाद मिश्रण waterbath में 30 मिनट के लिए सी सेते हैं.
- जी 1500 में 5 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं तलछट नमूने अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के 100ml एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आसुत पानी की 100ml जोड़ें.
- एक थाली स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 540nm में नमूने के absorbance पढ़ें.
गणना
- प्रत्येक नमूना के लिए मतलब absorbance की गणना
- सभी नमूनों से रिक्त absorbance (सहज lysis) घटाएँ
- प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग% lysis की गणना:
- क्षैतिज अक्ष पर सीरम कमजोर पड़ने बनाम प्रतिशत lysis (अनुलंब अक्ष) प्लॉट.
- नियंत्रण और परीक्षण सीरम (चित्र 2) के लिए 50% haemolysis के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की गणना.
प्रतिनिधि परिणाम:
वीडियो प्रतिनिधि के परिणाम का एक उदाहरण भी शामिल है. अभ्यास में, एक नियंत्रण सीरम भी परीक्षण सीरम के रूप में एक ही समय पर चलाया जाता है और एक ही तरीके से इलाज. नीचे (1 टेबल) नमूना डेटा से एक परीक्षण सीरम नमूना है. डेटा 5.3 में प्रस्तुत समीकरण के अनुसार चालाकी है.
| नमूना | 540 आयुध डिपो | मीन | ||
| रिक्त | 0.044 0.042, | 0.043 | ||
| कुल lysis | 0.183 0.183, | 0.183 | ||
| 540 आयुध डिपो | मीन | मतलब रिक्त | % Lysis | |
| 01:08 | 0.219 0.200, | 0.210 | 0.168 | 116 |
| 1:16 | 0.173 0.179, | 0.176 | 0.134 | 93 |
| 1:32 | 0.110 0.134, | 0.122 | 0.08 | 55 |
| 1:64 | 0.066 0.053, | 0.059 | 0.017 | 12 |
| 1:128 | 0.045 0.044, | 0.045 | 0.003 | 2 |
चित्रा 1. शास्त्रीय पूरक मार्ग के सक्रियकरण शास्त्रीय मार्ग बाध्यकारी immunoglobulin (आईजीएम) एम या immunoglobulin जी (आईजीजी) द्वारा एक लक्ष्य कक्ष की सतह पर सक्रिय है. अब के एफसी भाग C1q को बांधता है, C1r सक्रिय है और इस बारी में C1r के एक अणु है जो एक साथ C1s के दो अणुओं को सक्रिय सक्रिय. C1s अब C4 जो जो भी cleaved है C2 के लिए बाध्यकारी साइट को उजागर cleaves. C4b और C2a के बंधन एक C3 convertase के रूप में निर्दिष्ट परिसर के गठन की ओर जाता है है. इस परिसर में अब C3 बनाने C3a और C3b, जिनमें से कुछ एक C5 convertase बनाने C3 convertase के साथ गठबंधन cleaves. इस परिसर में अब C5 पर जिसके परिणामस्वरूप C6 झिल्ली हमले जटिल (मैक) के गठन की शुरुआत के लिए बाध्य C5b के साथ कार्य करता है. C7 पर C5b6 कार्य करता है, जो C8 पर बारी के कार्य में और अंततः C9 पर अंतिम मैक के गठन में जिसके परिणामस्वरूप. (Goldsby एट अल, 2003).
चित्रा 2. नमूना डेटा की साजिश रचने और एक नियंत्रण और परीक्षण सीरम नमूना के लिए CH50 की गणना (ए), दोनों (•) नियंत्रण और परीक्षण () सीरम नमूनों की गणना प्रतिशत (%) lysis कमजोर पड़ने कारक के खिलाफ प्लॉट किए जाते हैं. (ख) 50% lysis की गणना करने के लिए, 50% प्रतिशत मान से एक लाइन तैयार की है जब तक यह ग्राफ लाइनों के साथ intersects और तो एक खड़ी रेखा के नीचे कमजोर पड़ने के लिए तैयार है. इस उदाहरण में, नियंत्रण और परीक्षण सीरम 21.6 गुना कमजोर पड़ने के 35 गुना के एक कमजोर पड़ने के लिए 50% lysis प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. इस डेटा को इंगित करता है कि वहाँ कम नियंत्रित करने के लिए की तुलना में यह कम कमजोर पड़ने की आवश्यकता से पहले 50% lysis पहुँच गया था पूरक परीक्षण सीरम में मौजूद है. नियंत्रण नमूना 01:08 कमजोर पड़ने पर भी lysis> 100% से पता चलता है. यह सबसे अधिक संभावना है आसुत पानी से और पूरक घटकों द्वारा अधिक कुशल lysis SRBC की अधूरी lysis के कारण है.
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Discussion
सीएच 50 परख कई interferences के अधीन है. कुछ SRBC अधिक दूसरों की तुलना में कमजोर हैं, सहज haemolysis है कि गतिविधि पूरक करने के लिए असंबंधित है में जिसके परिणामस्वरूप. खरगोश एंटीबॉडी की आत्मीयता से बहुत बहुत और एक निर्माता से दूसरे बदलता है, यह एंटीबॉडी है कि SRBC के लिए बांध की राशि को प्रभावित करता है. इसके अलावा, एंटीबॉडी कोटिंग SRBC की मात्रा भिन्न के साथ कोशिकाओं में एंटीबॉडी परिणामों के साथ SRBC सुग्राही बनाने की प्रक्रिया. नमूना संग्रह और भंडारण त्रुटि का एक महत्वपूर्ण संभावित स्रोत हैं. पूरक घटक जैसे C1q, C3, C4 और C5 बहुत अस्थिर कर रहे हैं, तो उचित नमूना हैंडलिंग महत्वपूर्ण है. गर्मी के लम्बे समय तक जोखिम पूरक गतिविधि में कमी और पूरक घटकों के निष्क्रिय टुकड़े का उत्पादन होगा. त्रुटि के कई स्रोतों के रूप में संभव के रूप में पता लगाने के लिए, यह एक ज्ञात सीएच 50 मूल्य के साथ एक नियंत्रण सीरम हर बार परख प्रदर्शन किया है परीक्षण और ज्ञात सीरम नियंत्रण के स्वीकार किए जाते हैं मान पुन : पेश करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक तरीका निर्धारित करने के लिए अगर वहाँ SRBC और haemolysin के विभिन्न बैचों के बीच कोई मतभेद हैं के सीरम कई बार के एक मानक नमूना के खिलाफ नए परीक्षण सामग्री परीक्षण और फिर से निर्धारित है अगर वहाँ haemolysis के बेसल स्तर में या सीएच 50 मूल्य में कोई परिवर्तन कर रहे हैं नियंत्रण सीरम के लिए.
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Acknowledgments
लेखक और छायांकन के लिए तकनीक श्री पॉल शेफर्ड के प्रदर्शन के लिए मिस Lora मैथ्यू धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना दक्षिण ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय, प्रयोगशाला मेडिसिन प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sheep red blood cells | CSL | 2490201 | Use at 1% final |
| Serum | Human serum | ||
| Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated | AbD Serotec | C12HSB | |
| 96 well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1839 | |
| Veronal buffered saline | Use at 1x final | ||
| Waterbath | |||
| Plate reader | |||
| 37°C room/incubator |
References
- Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (2003).
