Mätning av 50% Hemolytisk Komplement (CH ₅₀) Aktivitet av serum

Summary

Den klassiska vägen aktiveras av antikroppar och kulminerar i mål cellslys. CH

Abstract

Komplementsystemet är en grupp av proteiner som när den aktiveras leder till målcellen lys och underlättar fagocytos genom opsonisation. Individuella komplement komponenter kan kvantifieras men detta inte ger någon information om verksamheten i vägen. CH

Protocol

Beredning av 5x buffrat Veronal saltlösning (VBS)

1. För att förbereda Veronal saltlösning (VBS), tre separata lösningar behöver förberedas.
2. Bered en genom att lösa 21.25gm av NaCl och 0.94gm av Sodium SÖMNMEDEL i 350 ml destillerat vatten. Den slutliga koncentrationer av NaCl och natrium SÖMNMEDEL är 1,02 m och 13 mm respektive.
3. Bered 2 genom att lösa 1.44gm av SÖMNMEDEL i 125ml varmt destillerat vatten. Den slutliga koncentrationen av SÖMNMEDEL är 62.5mM.
4. Bered 3 genom att lösa 20.33gm av MgCl ₂ och 4.41gm av CaCl ₂ i 100 ml destillerat vatten. Den slutliga koncentrationen av MgCl ₂ och CaCl ₂ är 2.18M och 440 respektive.
5. Blanda lösningar 1 och 2 och svalna till rumstemperatur.
6. När den kombinerade lösningen har svalnat, tillsätt 1,25 ml av lösning 3 och justera pH till 7,3-7,5 med 1M HCl.
7. Justera den slutliga volymen till 500 ml med destillerat vatten för att förbereda en 5x stamlösning.
8. För att förbereda en 1x fungerande lösning, späd beståndet 1:05 med destillerat vatten.

Sensibilisering av får röda blodkroppar med haemolysin

1. Förbered haemolysin genom att först späda den 1:50 med VBS
2. Till 4 ml av SRBC lägga 6ml av VBS och försiktigt blanda genom inversion
3. Centrifugera vid 600g x 5minutes
4. Kasta bort vätskefasen och tvätta cellerna ytterligare 2 gånger
5. Efter den sista tvätten, centrifugera cellerna på 900g x 5minutes att packa cellerna
6. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i tillräckligt VBS att förbereda en 10% lösning, dvs 0,5 ml packade celler resuspenderas i 5 ml buffert
7. Droppvis lägga en lika stor volym haemolysin (kanin anti-Får röda blodkroppar antikroppar) till celler medan virvlande kontinuerligt
8. Inkubera vid 30 ° C i 30 minuter i ett vattenbad
9. Blanda försiktigt cellerna varje 15minutes
10. Strålningskänsliga SRBC kan lagras över natten vid 4 ° C

CH ₅₀ assay

1. Etikett en serie rör dubbelt med 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 och 1:128.
2. Bered en serie av två gånger spädningar av kontroll och testserum i VBS varje i två exemplar
3. Start kl 01:04 (100ml serum + 300ml VBS) och överför 200 ml prov till nästa märkt rör.
4. Blanda noggrant mellan spädningar och 200ml överföra till nästa spädning med en ny pipettspets.
5. Upprepa tills alla fem spädningar görs.
6. Kasta 200ml från den slutliga 1:128 utspädning.
7. Tillsätt 200 ml av suspenderade sensibiliserade SRBC till alla rör.
8. Märk två separata rör som tomma och tillsätt 200 ml av sensibiliserade SRBC + 200ml VBS. Dessa rör kommer att mäta spontana lysering av SRBC i VBS.
9. Etikett ytterligare två separata rör enligt TOTAL lys och lägga 200 ml sensibiliserade SRBC + 200 ml destillerat vatten.
10. Blanda försiktigt alla rör.
11. Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter i ett vattenbad blanda efter 15 minuter.
12. Centrifugera proverna vid 1500 g under 5 minuter till sediment de röda blodkropparna.
13. Överför 100 ml av supernatanten från varje rör till en brunn i en 96 och flat botten plattan.
14. Tillsätt 100 ml destillerat vatten i varje brunn.
15. Läs absorbansen hos exemplaren vid 540nm med en tallrik spektrofotometer.

Beräkningar

1. Beräkna medelabsorbansen för varje prov
2. Subtrahera BLANK absorbansen (spontan lys) från alla prover
3. Beräkna% lys för varje spädning enligt följande formel:
   
4. Plotta den procentuella lys (vertikal axel) jämfört med serum utspädning på den horisontella axeln.
5. Beräkna utspädning krävs för 50% hemolys för kontroll och testserum (Fig. 2).

Representativa resultat:

Videon innehåller ett exempel på representativa resultat. I praktiken är en kontrollserum också köra samtidigt som testserumet och behandlas på samma sätt. Nedan (Tabell 1) är exempeldata från en beprövad serumprov. Uppgifterna manipuleras enligt följande ekvation som presenteras i 5.3.

Exempel på	OD 540	Medel
Blank	0,042, 0,044	0,043
Totalt lys	0,183, 0,183	0,183
	OD 540	Medel	Medel-Blank	% Lysis
01:08	0,200, 0,219	0,210	0,168	116
01:16	0,179, 0,173	0,176	0,134	93
01:32	0,134, 0,110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0,044, 0,045	0,045	0,003	2

Figur 1. Aktivering av den klassiska komplement vägen. Den klassiska vägen aktiveras genom att binda immunglobulin M (IgM) eller immunoglobulin-G (IgG) på ytan av ett mål cell. Fc-delen av Ab binder till C1q är C1r aktiveras och detta i sin tur aktiverar en annan molekyl C1r som tillsammans aktiverar två molekyler av C1s. C1s klyver nu C4 som exponerar Bindningsstället för C2 som även klyvs. Bindningen av C4b och C2a leder till bildandet av en komplex kallas C3 convertase. Detta komplex klyver nu C3 bilda C3a och C3b, av vilka kombineras med C3 convertase bildar en C5 convertase. Detta komplex agerar nu på C5, med den resulterande C5b bindning till C6 initiera bildandet av membranet attack komplexet (MAC). C5b6 agerar på C7, vilket i sin tur agerar på C8 och i slutändan på C9 resulterar i bildandet av den slutliga MAC. (Goldsby et al, 2003).

Figur 2. Plottning av urval av data och beräkning av CH50 för en kontroll och testserumprov. (A), är beräknade andel (%) lysering av både kontroll (•) och test () serumprover plottas mot utspädningsfaktorn. (B) för att beräkna 50% lys är en linje från 50% procent värde tills den skär med grafen linjer och sedan en vertikal linje dras ner till utspädning. I detta exempel är en 35-faldig utspädning av kontroll och 21,6-faldig utspädning av testserumet krävs för att uppnå 50% lys. Dessa data tyder på att det är mindre komplement närvarande i testserumet jämfört med kontrollgruppen som det krävs mindre utspädning innan 50% lys nåddes. Kontrollprovet visar också> 100% lys vid 1:08 spädning. Detta beror sannolikt på grund av ofullständig lysering av SRBC av Destillerat vatten och effektivare lysering av komplement komponenter.

Discussion

CH _50-analysen är föremål för många störningar. Några SRBC är mer ömtåliga än andra, vilket resulterar i spontana hemolys som inte har med komplement aktivitet. Affinitet kanin antikroppar varierar från parti till parti och från en tillverkare till en annan, vilket påverkar mängden antikroppar som binder till SRBC. Även arbetet med sensibiliserande SRBC med antikropp resulterar i celler med olika mängder antikroppar beläggning SRBC. Provtagning och lagring är en viktig potentiell källa till fel. Komplettera komponenter t.ex. C1q-, C3, C4 och C5 är extremt instabilt, är så korrekt provhantering kritisk. Långvarig exponering för värme minskar komplement till verksamheten och kommer att producera inaktiva fragment av komplement komponenter. För att upptäcka så många felkällor som möjligt är det viktigt att testa en kontrollserum med en känd CH ₅₀ värde varje gång analysen utförs och att återge accepterade värdet av det kända serumet kontroll. Ett sätt att avgöra om det finns några skillnader mellan olika partier av SRBC och haemolysin är att testa nya testmaterial mot ett standardprov av serum flera gånger och sedan bestämma om det finns några förändringar i den basala nivån av hemolys eller i CH _50-värdet för kontrollserum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator