Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

Summary

Medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Este protocolo destaca os pontos chave para a microinjeção de sucesso em embriões medaka, uma técnica importante para a análise embriológica e genética utilizando medaka zebrafish e em um laboratório.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos a técnica da microinjeção em embriões de uma célula estágio medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos organismos modelo de vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas ^1, como no peixe-zebra eo mouse. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie ^2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados.

Para aproveitar medaka peixes cujos embriões são transparentes e desenvolver externamente, microinjeção é uma técnica essencial para injetar células-traçadores para as células rotulagem, mRNAs ou sentido anti-oligonucleotides para o excesso de expressar e batendo-down genes de interesse, e para a tomada de DNAs linhagens transgênicas.

Protocol

1. Acasalamento e coleta de ovos

1. Medaka feminino e masculino podem ser facilmente distinguidas pelo tamanho e forma das barbatanas dorsal e anal. As barbatanas anal dos machos são maiores e em forma de paralelogramo comparada com a das fêmeas. A barbatana anal do sexo feminino é menor e em forma triangular. A barbatana dorsal do sexo masculino tem um entalhe claramente visível profunda entre os dois últimos raios.
2. Medaka colocar até 40 ovos todos os dias e as fêmeas carregam os ovos medaka agrupado em sua barriga por filamentos de ligação para várias horas antes de serem arrancados de plantas no tanque.
3. Fêmeas pode ser pego em uma rede mantido dentro suavemente de ambos os lados por um lado. Os ovos podem ser suavemente arreliado da barriga com o dedo indicador da outra mão. A fêmea pode então ser devolvido ao tanque. Os ovos devem ser transferidos para uma placa de Petri 6 centímetros cheia de mídia embrião por fórceps sem corte ou um dedo.
4. Pares Medaka raramente luta quando eles são mantidos em uma caixa pequena de acasalamento. Portanto, eles podem ser mantidos em um pequeno tanque com fluxo de água para que possam ser alimentados e os ovos podem ser coletados a partir do mesmo par todos os dias por um par de meses.
5. É importante que os peixes fêmeas não devem ser mantidos sem machos, uma vez que a ovulação ocorre todos os dias em medaka fêmeas. Caso contrário, as fêmeas não podem entregar os ovos e tornar-se indisposto.

2. Embriões de limpeza

1. Transferência unclustered ovos com uma pipeta de vidro a lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d'água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões.
2. Rolo delicadamente sobre embriões lixa usando o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície do papel de areia por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa do córion. Não enrole mais de embriões 07/05 de uma vez esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro.
3. Transferência de embriões limpo para um prato fresco de meio de embrião.

3. Fazer placas de agarose para a realização de embriões durante a microinjeção

Embriões são mantidos em bebedouros durante a injeção feita com um molde de acrílico em agarose 1,5% (Figura 1). A concentração de agarose é importante para manter os embriões corretamente.

1. Primeiro, faça um quadro de agarose para segurar o molde de acrílico. Despeje de agarose 1,5% em água a uma profundidade 0,5 cm em uma placa de Petri nove centímetros e espere até que ele se solidifica completamente. Cortar uma área da agarose apenas maior que o tamanho do molde.
2. Despeje de agarose 1,5% para preencher a área de corte e coloque o molde para que não haja bolhas e espere até que agarose solidifica. Esta placa de agarose podem ser armazenados na geladeira para acelerar solidifaction.
3. Remover o molde para criar calhas para segurar os ovos. Adicionar médio embrião o suficiente para mergulhar o molde, cubra e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
   
   
   Figura 1. Esquemática do molde feito sob medida usada para preparar as calhas em placas de agarose para microinjeção.

4. Microinjeção de embriões medaka

Em medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morfolino e corantes traçador são microinjeção através do córion para o citoplasma da 1-64 de células de embriões, em vez de estágio a gema como em zebrafish. Uma vez que o citoplasma é menor e menos visível na medaka, a prática pela injeção de corantes como rodamina-dextran é recomendado para desenvolver esta habilidade. Além do vermelho de fenol como traçador também é estimulada para permitir a confirmação das injeções.

Como o córion torno embriões medaka é dura, um short, agulha de injeção forte e ampla é necessária (Figura 2). Prepare esta agulha de injeção forte de largura a partir de um filamento de vidro contendo-capilar.

1. Preparar a solução de injeção com vermelho de fenol como traçador e carregá-lo para dentro da agulha na parte de trás com um microloader Eppendorf. Conecte a agulha para a bomba de ar do injetor.
2. Os ovos devem ser recolhidos e unclustered o mais rapidamente possível após a fertilização para injetar na fase de uma célula. Mais embriões podem ser injetadas, armazenando-os em gelo (não mais de 30 minutos) para interromper a divisão celular.
   
   
   Figura 2. Comparação de agulhas e medaka zebrafish. Observe a ponta da agulha MF (em cima) é mais curto e mais largo, portanto, mais forte para a perfuração do córion dura em torno de embriões medaka.
3. Transferência de ovos na placa de agarose e alinhá-las nos bebedouros com uma pinça. Imediatamente antes da injecção, cinco ovos, devem ser mudados para que a membrana da célula do citoplasma de uma célula pode ser atingido por diaagulha e perpendicularmente. O citoplasma da célula de um pode ser encontrado por olhar para uma área desprovida de pequenas gotículas de óleo que fica em frente ao lado do ovo com gotas de óleo mais denso. A área identificada pode ser confirmado para ser o citoplasma através da visualização de lado.
4. Coloque a agulha para fechar os ovos. Abra a ponta da agulha suavemente tocar a ponta da agulha para o córion ou usando micropinças (Figura 3). Uma pequena quantidade de substância injecção deve ser visto a fluir para fora.
5. Punção através do córion para colocar a ponta da agulha no interior do córion. Ajuste a pressão de realização do injector a ser relativamente alto, para garantir que nenhum refluxo ocorre devido à alta pressão sobre punção através do córion resistente (configurações de 80-100hPA para exploração e pressão de 500 700hPa para a pressão de injeção).
6. Insira a ponta da agulha para o citoplasma acentuadamente por cutucando sua membrana.
   
   Evite inserir a ponta da agulha na gema. Ao contrário de peixe-zebra, material injetado na gema não será transferido para o citoplasma. Líquidos injetados tem um limite diferente quando injetado na gema enquanto que o limite é turva quando no citoplasma (Figura 4).
   
   Ocasionalmente, a agulha pode ficar bloqueado por agarose / detritos. Fórceps pode ser usado para tocar / quebrar novamente a ponta da agulha e remova o bloqueio. Se a agulha quebra em qualquer ponto durante a injeção, borbulhando será visto no meio de embrião e que a substância está a injectar será perdido. As injeções devem ser realizadas sistematicamente de cima para baixo ao longo dos canais agarose e da esquerda para a direita através do molde.
7. Embriões injetados devem ser transferidos para um prato limpo contendo meio de embrião e desenvolvido na temperatura adequada.
   
   
   Figura 3. Quebrar a ponta da agulha antes da injeção. 1: Mova a ponta da agulha perto do córion do embrião; 2: Toque no córion e mover a agulha para trás e para frente com cuidado para quebrar ponta; 3: Quando uma pequena quantidade de substância de injeção flui para fora da extremidade da agulha isto confirma a quebra da ponta.

5. Resultados representativos

Figura 4. Imagens representativas de embriões injetados medaka. Um painel mostra uma imagem representativa da injeção correta de rodamina-dextran no citoplasma de uma célula embrionária de um estágio medaka. Painel B mostra uma imagem representativa de injeção incorreta de rodamina-dextran no saco vitelino de uma célula do embrião estágio medaka. Painéis C e D mostram os embriões a partir de painéis A e B, respectivamente, cerca de 30 horas após a injecção. EM: embrião, anterior é para cima em painéis C e D e vista é dorsal. Observe o corpo do embrião no painel D não é vermelho como o corante foi incorretamente injetado no saco vitelino. Setas em B e D indicam rodamina-dextran injetado incorretamente no saco vitelino observe o limite distintos circular. Linhas pontilhadas em A e B indicam esboço do citoplasma de uma célula, visão é lateral.

Discussion

Neste vídeo, demonstramos um método para rastreamento de células, mRNA, ou DNA anti-senso de injeção de oligonucleotídeos em uma célula de embriões estágio medaka. Esta técnica permitiu-nos para estudar vários processos de desenvolvimento in vivo, em tempo real. Este processo e posterior análise detalhada que proporciona tem o potencial de aumentar significativamente a nossa compreensão da organogênese vertebrados e da biologia da célula subjacente. Tal conhecimento pode ser importante para, e rendimento de aplicações terapêuticas na medicina regenerativa.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.