Mikroinjektion av medaka embryon för att användas som en modell genetisk organism

Summary

Medaka och zebrafisk är kompletterande för genetisk dissektion av ryggradsdjur genomet funktioner. Detta protokoll belyser de viktigaste punkterna för en lyckad mikroinjektion i medaka embryon, en viktig teknik för embryologiska och genetisk analys med medaka och zebrafisk i ett laboratorium.

Abstract

I denna video visar vi tekniken med mikroinjektion i en cell medaka skede embryon. Medaka är ett litet äggläggande sötvattensfisk som tillåter både genetiska och embryologiska analyser och är en av de ryggradsdjur modell organismer i vilka arvsmassan hela fenotyp driven mutant skärmar genomfördes ^1, som i zebrafisk och musen. Avvikelse av funktionell överlappning av gener mellan medaka och zebrafisk möjliggör identifiering av nya fenotyper som är oidentifierbara i en enda art ^2, vilket medaka och zebrafisk är kompletterande för genetisk dissektion av ryggradsdjur genomet funktioner.

För att dra nytta av medaka fisk vars embryon är transparenta och utvecklas externt, är mikroinjektion en viktig teknik för att injicera cell-spårämnen för märkning av celler, mRNA eller anti-känsla oligonukleotider för över-uttrycka och knackar ner gener av intresse och DNA för att göra transgena linjerna.

Protocol

1. Parning och samla ägg

1. Kvinnliga och manliga medaka kan lätt urskiljas av storleken och formen på anal-och ryggfenor. Den analfenorna av hanarna är större och parallellogram-formade jämförelse med honorna. Den kvinnliga analfena är mindre och triangelformad. Den manliga ryggfenan har en tydlig djup skåra mellan de två sista strålar.
2. Medaka lägger upp till 40 ägg varje dag och medaka honor bär äggen klustrade på sin mage genom att förankras trådar i flera timmar innan de klädde av sig på växter i tanken.
3. Kvinnor kan fångas i ett nät och höll inne försiktigt från båda sidor av en hand. Ägg kan sedan försiktigt retade från magen med pekfingret i den andra handen. Honan kan sedan tillbaka till tanken. Ägg skall överföras till en 6 cm petriskål fylld med embryo media genom trubbigt pincett eller ett finger.
4. Medaka par slåss sällan när de förvaras i en liten parning låda. Därför kan de förvaras i en liten tank med vattenflödet så att de kan matas och ägg kan hämtas från samma par varje dag i ett par månader.
5. Det är viktigt att honan inte ska hållas utan män, eftersom ägglossningen inträffar varje dag i medaka kvinnor. Annars kan kvinnor inte leverera ägg och bli sjuk.

2. Rengöring embryon

1. Överför unclustered ägg med ett glas pipett till sandpapper (P2000 kornstorlek, vattentät) placeras i locket på en 9cm petriskål. Ta bort överflödig medium men säkerställa en tillräcklig volym kvar för att förhindra uttorkning av embryon.
2. Rulla försiktigt embryon på sandpapper du använder pekfingret, tillämpa minimala tryck och hålla fingret parallell med ytan av sandpapper för cirka 45-60 sekunder för att ta bort några av den yttre ytan hårstrån på chorion. Rulla inte mer än 5-7 embryon på en gång denna försiktighetsåtgärd kommer att minimera klämrisk embryon under varandra.
3. Överföring rengöras embryon till en ny maträtt av embryon medium.

3. Göra agarosen plattor för att hålla embryon vid mikroinjektion

Embryon hålls i tråg under injektion görs med ett plexiglas mögel i 1,5% agaros (figur 1). Koncentrationen av agaros är viktigt att hålla embryon ordentligt.

1. Gör först en ram av agaros att hålla plexiglas mögel. Häll 1,5% agaros i vatten till en 0.5cm djup i en 9cm petriskål och vänta tills det helt stelnar. Klipp ut ett område i agarosen bara större än storleken på formen.
2. Häll 1,5% agaros att fylla skära området och placera formen så att inga bubblor är fångade och vänta tills agaros stelnar. Detta agarosen plattan kan förvaras i kylskåp för att påskynda solidifaction.
3. Ta bort mögel att skapa tråg för att hålla äggen. Lägg tillräckligt embryo medelhög att fördjupa formen, täck och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
   
   
   Figur 1. Schematisk av skräddarsydda mögel används för att förbereda dalar i agaros plattor för mikroinjektion.

4. Mikroinjektion av medaka embryon

I medaka är DNA, RNA, morpholino oligonukleotider och färgämnen spårämne idag injiceras genom chorion i cytoplasman av 1 till 64-cells stadiet embryo snarare än gulan som i zebrafisk. Eftersom cytoplasman är mindre och mindre synlig i medaka, praxis genom att injicera färgämnen som Rhodamine-dextran rekommenderas att utveckla denna färdighet. Tillägg av fenolrött som spårgas uppmuntras också att låta en bekräftelse på injektioner.

Som chorion omgivande medaka embryon är tufft, är en kort, kraftig och bred injektionsnål behövs (Figur 2). Förbered denna starka brett injektionsnål från en glödtråd-innehållande glas kapillär.

1. Förbered injektionslösningen med fenolrött som spårgas och ladda in den i nålen från baksidan med en Eppendorf microloader. Anslut nålen till luftpumpen injektorn.
2. Ägg skall samlas in och unclustered så snart som möjligt efter befruktning att injicera på en-cells skede. Mer embryon kan injiceras genom att lagra dem på is (inte mer än 30 minuter) för att stoppa celldelningen.
   
   
   Figur 2. Jämförelse av medaka och zebrafisk nålar. Notera toppen av MF nål (överst) är kortare och bredare därmed starkare för punktera den tuffa chorion omgivande medaka embryon.
3. Överför ägg till agarosen plattan och rikta in dem i tråg med pincett. Strax före injektion ska fem ägg vridas så att cellmembranet av en-cells cytoplasma kan drabbas av ee nål vinkelrätt. Cytoplasman i en cell kan hittas genom att leta efter ett område som saknar små oljedroppar som är motsatsen till den sida av ägget med tätaste oljedroppar. De identifierade området kan bekräftas vara cytoplasman genom att titta från sidan.
4. Placera nålen i närheten av äggen. Öppna nålspetsen genom att försiktigt vidröra spetsen på nålen till chorion eller använda microforceps (Figur 3). En liten mängd injektion ämne bör ses kan rinna ut.
5. Punktering genom chorion att placera nålspetsen inuti chorion. Justera hålla trycket injektorn vara relativt hög, att garantera att inga uppstötningar uppstår på grund av det höga trycket på punktering genom tuffa chorion (inställningar för 80-100hPA för att hålla trycket och 500-700 hPa för injektion tryck).
6. Sätt spetsen på nålen i cytoplasman genom att kraftigt peta dess membran.
   
   Undvik att sticka in spetsen av nålen i äggula. Till skillnad från zebrafisk kommer materialet sprutas in i äggulan inte överföras i cytoplasman. Injiceras vätskor har en tydlig gräns när det injiceras i äggulan medan gränsen är suddig när i cytoplasman (Figur 4).
   
   Ibland nålen kan bli blockerad av agaros / skräp. Tång kan användas för att röra / rebreak slutet av nålen och ta bort blockeringen. Om nålen går sönder när som helst under injektion kommer bubblande ses i embryot mediet och det ämne du injicerar kommer att förloras. Injektionerna bör utföras systematiskt från topp till botten längs agaros kanaler och från vänster till höger över formen.
7. Injicerade embryon skall överföras till en ren skål som innehåller embryot medium och utvecklats vid lämplig temperatur.
   
   
   Figur 3. Bryta nålspetsen före injektion. 1: Flytta nålspetsen nära chorion av embryon, 2: Tryck på chorion och flytta nålen fram och tillbaka försiktigt att bryta spetsen, 3: När en liten mängd injektion ämne strömmar ut i slutet av nålen Detta bekräftar brott i spetsen.

5. Representativa resultat

Figur 4. Representant bilder av injiceras medaka embryon. Panel A visar en representativ bild av riktig injektion av Rhodamine-dextran i cytoplasman i en en-cells stadiet medaka embryo. Panel B visar en representativ bild av felaktig injektion av Rhodamine-dextran i gulesäcken med ett en-cells stadiet medaka embryo. Paneler C och D visar embryon från panelerna A respektive B på cirka 30 timmar efter injektion. EM: embryo är främre uppåt i panelerna C och D samt uppfattning är rygg. Notera själva embryot i panel D är inte röd som färgen felaktigt injiceras i gulesäcken. Pilar i B och D visar Rhodamine-dextran injiceras felaktigt i gulesäcken notera distinkt cirkulär gränsen. Streckade linjerna i A och B visar konturerna av cytoplasman i en cell är för lateralt.

Discussion

I denna video visar vi en metod för cell spårämne, mRNA, DNA eller anti-sense oligonukleotid injektion i en cell medaka skede embryon. Denna teknik har gett oss möjlighet att studera olika utvecklingsprocesser in vivo i realtid. Denna process, de därpå följande detaljerad analys det ger har potential att väsentligt öka vår förståelse av ryggradsdjur organogenesen och den underliggande cellbiologi. Sådan kunskap kan vara viktigt för, och ge terapeutiska tillämpningar inom regenerativ medicin.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.