Summary
يتم استخدام الحبل السري لعزل خلايا العضلات الملساء بطرق مختلفة. في هذا العمل استخدمنا العلاج الأنزيمية لعزل خلايا العضلات الملساء.
Abstract
الحبل السري البشري (جامعة كاليفورنيا) هو عينة البيولوجية التي يمكن الحصول عليها بسهولة بعد الولادة. هذه العينة البيولوجية ، معظم الوقت ، وتجاهل جمعها لا ينطوي على أي خطر إضافة إلى صحة الأطفال حديثي الولادة أو والدة. وعلاوة على ذلك لا تثار مخاوف أخلاقية. وتتألف لجامعة كاليفورنيا واحد واثنين من الشرايين الوريد من الخلايا البطانية التي على حد سواء (ECS)
Protocol
- ويتم الحصول على قطع الشرايين من جامعة كاليفورنيا من 3-7 سم.
- تمت إزالة بعناية هلام وارتون الذي يحيط بقطع الشرايين مع المقص.
- تم إدخال إبرة حادة في نهاية وجود القطر الخارجي لل1MM 0.6 - 7mm حول واحدة من نهاية تشريح الشرايين.
- لإزالة ما تبقى في الدم داخل الأوعية ، وتعقد عموديا الشرايين وperfused مع حوالي 20 إلى 40 مل ، المحلول الملحي الفيزيولوجي (PSS) ، وذلك باستخدام الحقنة 20 مل متصلة إبرة. إذا لزم الأمر ، وتكرر هذه الخطوة الغسيل لعدة مرات.
- وتكرر نفس الإجراء باستخدام RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني (FBS).
- وأغلقت واحدة من أقصى الأوعية الدموية. تم توصيل حقنة 10 مل إلى الإبرة وperfused مع 3 مل من كولاجيناز النوع الأول (800 وحدة / مل في محلول ملح التخزين المؤقت للهانك (HBSS)). ثم extremityof الأخرى كما أغلقت السفينة.
- وقد حضنت السفينة مع الفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) ، لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الانفعالات.
- بعد أن ينتهي من قطع السفينة إلى جمع SMCs الحرة. ويروي شرايين مع ما يقرب من 20 حتي 40 مل من DMEM - F12 تستكمل مع 5 ٪ من FBS والمضادات الحيوية لأنبوب 50 مل.
- وكان طرد الأنبوب في درجة حرارة الغرفة (250 غرام ، 8 دقائق) ، وكان بيليه معلق الخلية في 5 مل من DMEM - F12 تستكمل مع 5 ٪ من FBS.
- تم نقل تعليق خلية إلى المغلفة الكولاجين T - القارورة والمحتضنة في 37 درجة مئوية ، في ظل مناخ 5 ٪ CO 2 مرطب.
- بعد إزالة 5 16 ساعة ، والخلايا غير ملتصقة وdrebis الخلوية ، واضافة 5 مل من المتوسط الثقافة وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في ظل مناخ 5 ٪ CO 2 مرطب.
- تم تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل خلية 2 3 أيام ، حتى وصلت SMCs التقاء.
- بعد تحقيق التقاء الخلايا أنها كانت المصنفة 25 سم الى اثنين أو ثلاثة من 2 T - القوارير.
تنظيف
- تخلص من الإبر الحادة في حاويات.
- تخلص من المحاقن في حاوية بيولوجية كبيرة.
- تطرح جميع الأنسجة داخل حقيبة صغيرة بيولوجية. إغلاق الكيس والتجميد في -20 درجة مئوية حتى الحرق.
- نقع في جميع الصكوك مبيد للفيروس على الأقل 10 دقيقة.
- عودة إلى البراد وسائط غير مستخدمة.
- التخلص من النفايات في قفازات واقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام SMC كنماذج لفحوصات المخدرات في المستقبل مع المضيقة ، لعزل وتوصيف هيكليا قنوات الكالسيوم من نوع L ، لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية وظيفة الأوعية الدموية واستخدامها في هندسة الأنسجة. ECS SMCs وأساسية لتطوير المواد الحيوية الجديدة التي يمكن استخدامها في إنتاج شبه الأوعية الدموية الاصطناعية لاستخدامها في البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
مستشفى Lusitano أماتو ، كاستيلو برانكو البرتغال.
مستشفى سوزا مارتينز ، جواردا البرتغال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
