脐带可通过不同方法用于分离平滑肌细胞。在本研究中，我们采用酶消化法来分离平滑肌细胞。
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摘要
摘要
人类脐带（UC）是一种在出生后即可轻松获取的生物样本。这种生物样本通常被丢弃，其采集不会对新生儿或母亲的健康带来任何额外风险。此外，该做法不涉及任何伦理问题。脐带由一条静脉和两条动脉组成，从中可分离出内皮细胞（ECs）1和平滑肌细胞（SMCs）2，血管的两种主要细胞成分，可被分离。在本项目中，平滑肌细胞（SMCs）是根据Jaffe先前描述的实验方案，通过酶处理脐动脉获得的等3细胞分离后，将其置于添加了5%胎牛血清的DMEM-F12培养基中进行t-flash培养，并连续传代数次。在不同代次中，细胞保持了其形态学及其他表型特征。本研究的目的是分离平滑肌细胞，以将其作为未来收缩药物实验的模型，分离并结构表征L型钙通道，以及研究血管功能的细胞和分子机制。4并将其应用于组织工程。
方案
- 从长度为 3-7 cm 的脐带组织块中获取动脉。
- 用剪刀小心去除包绕动脉的华通胶。
- 将外径为 0.6-1 mm 的钝头针插入已分离动脉的一端，插入深度约为 7 mm。
- 为清除血管内残留的血液，将动脉垂直持握，使用连接针头的 20 mL 注射器灌注约 20 至 40 mL 生理盐水溶液（PSS）。如有必要，重复此洗涤步骤数次。
- 使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基重复上述相同操作。
- 封闭血管的一端，将 10 mL 注射器连接至针头，并灌注 3 mL I 型胶原酶（800 单位/mL，溶于汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中），随后也将血管的另一端封闭。
- 将血管置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 37°C 条件下振荡孵育 15 分钟。
- 剪开血管两端以收集游离的平滑肌细胞（SMCs），然后将动脉用约 20 至 40 mL 添加 5% FBS 和抗生素的 DMEM-F12 培养基灌注至 50 mL 离心管中。
- 在室温下以 250 g 离心 8 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 5 mL 添加 5% FBS 的 DMEM-F12 培养基中。
- 将细胞悬液转移至胶原包被的 T 型培养瓶中，在 37°C、5% CO2 湿润环境中孵育。
- 5 至 16 小时后，去除未贴壁细胞及细胞碎片，加入 5 mL 新鲜培养基，并继续在 37°C、5% CO2 湿润环境中孵育细胞。
- 每 2 至 3 天更换一次细胞培养基，直至平滑肌细胞达到汇合状态。
- 细胞达到汇合后，将其传代至两个或三个 25 cm2 的 T 型培养瓶中。
清理
- 将针头丢弃至锐器容器中。
- 将注射器丢弃至大型生物危害容器中。
- 将所有组织放入小型生物危害袋中。封好袋子，并于 -20°C 冷冻保存，直至焚烧处理。
- 将所有器械在病毒灭活剂中浸泡至少 10 分钟。
- 将未使用的培养基放回冰箱。
- 将手套丢弃至生物危害废物容器中。
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讨论
平滑肌细胞（SMC）可作为未来与收缩类药物相关检测的模型，用于分离和结构表征L型钙通道，研究血管功能的细胞与分子机制，并可用于组织工程。平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞（ECs）对于开发新型生物材料至关重要，这些材料可用于制造半合成的人工血管，应用于人体。
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致谢
Hospital Amato Lusitano，卡斯特洛布兰科 葡萄牙。
Hospital Sousa Martins，瓜达 葡萄牙。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| 胎牛血清（FBS） | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 3103806 | |
| 胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| 抗生素 | 每 1 mL 培养基添加 10 μL | ||
| 剪刀 | 已灭菌 | ||
| 针头 | 直径 0.6–1 mm | ||
| 注射器 | 10–20 mL | ||
| 生理盐水溶液（PSS） | 每条动脉 20–40 mL | ||
| I 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 每条动脉 3 mL |
| Hank’s 平衡盐溶液（HBSS） | 稀释后的胶原酶 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 预热至 37°C |
参考文献
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
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