Summary
De navelstrengen worden gebruikt om de gladde spiercellen isoleren door op verschillende manieren. In dit werk gebruikten we de enzymatische behandeling voor geïsoleerde gladde spiercellen.
Abstract
De menselijke navelstreng (UC) is een biologisch monster dat gemakkelijk kan worden verkregen net na de geboorte. Dit biologisch monster is, de meeste van de tijd, weggegooid en hun collectie impliceert geen extra risico's voor de pasgeborene of de moeder de gezondheid. Bovendien is er geen ethische bezwaren worden verhoogd. De UC is samengesteld door een ader en twee slagaders van waaruit zowel de endotheelcellen (EC)
Protocol
- Slagaders zijn verkregen uit UC stukken van 3-7 cm.
- Wharton's gelei, dat de slagaders rond werd zorgvuldig verwijderd door te snijden met een schaar.
- Een stompe-end naald van een uitwendige diameter van 0,6-1mm is ingevoegd ongeveer 7mm van het ene eind van de ontleed slagaders.
- Voor het verwijderen van het bloed in de resterende schepen, zijn de slagaders verticaal wordt gehouden en geperfuseerd met, ongeveer 20 tot 40 ml, fysiologische zoutoplossing (PSS), met behulp van een 20-ml-spuit is aangesloten op een naald. Indien nodig, werd deze wasstap herhaald voor meerdere keren.
- Dezelfde procedure werd herhaald met RPMI 1640 aangevuld met 10% van foetale bovine serum (FBS).
- Ene uiteinde van het bloedvat was gesloten. Een 10-ml-spuit is aangesloten op de naald en geperfuseerd met 3 ml collagenase type I (800 unit / mL in gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS)). Dan is de andere extremityof het schip was ook gesloten.
- Het schip werd geïncubeerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gedurende 15 min bij 37 ° C onder roeren.
- Na de uiteinden van het schip werden gesneden om het vrije SMC's te verzamelen. De slagaders werden perfuseren met ongeveer 20 tot 40 ml DMEM-F12 aangevuld met 5% van FBS en antibiotica om een 50-mL buis.
- De buis werd gecentrifugeerd bij kamertemperatuur (250 g, 8 min), en cel-pellet werd geresuspendeerd in 5 ml DMEM-F12 aangevuld met 5% van FBS.
- De cel suspensie werd overgebracht naar een collageen gecoate T-kolf en geïncubeerd bij 37 ° C, onder een 5% CO 2 vochtige atmosfeer.
- Na 5 16 uur, de niet-hechtende cellen en cellulaire drebis werden verwijderd, 5 ml kweekmedium werd toegevoegd en de cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C, onder een 5% CO 2 vochtige atmosfeer.
- De cel cultuur media werd veranderd om de 2 3 dagen, tot de SMC bereikt samenvloeiing.
- Na de cellen bereikt samenvloeiing ze werden uitgezet in twee of drie 25 cm 2 T-kolven.
Schoonmaken
- Gooi de naalden in de naaldencontainer.
- Gooi spuiten in grote biohazard container.
- Zet alle weefsel in een kleine biohazard tas. Sluit het zakje en invriezen bij -20 ° Celsius tot verbranding.
- Geniet van alle instrumenten in virucide gedurende minstens 10 minuten.
- Ongebruikte media koelkast.
- Gooi de handschoenen in biologisch afval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De SMC kan gebruikt worden als model voor toekomstige testen met constrictor drugs, te isoleren en structureel te karakteriseren L-type calcium kanalen, de cellulaire en moleculaire aspecten van de vasculaire functie te bestuderen en ze te gebruiken in tissue engineering. SMC's en EC's zijn fundamenteel voor de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen die gebruikt kunnen worden in de productie van semi-synthetische bloedvaten om te worden gebruikt bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ziekenhuis Amato Lusitano, Castelo Branco Portugal.
Ziekenhuis Sousa Martins, Guarda Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
