Summary
Die Nabelschnur werden verwendet, um Zellen der glatten Muskulatur durch verschiedene Arten zu isolieren. In dieser Arbeit verwendet die enzymatische Behandlung zu isolierten glatten Muskelzellen.
Abstract
Die menschliche Nabelschnur (UC) ist eine biologische Probe, die einfach nur nach der Geburt erreicht werden kann. Diese biologische Probe, die meiste Zeit, verworfen, und ihre Erhebung bedeutet keine zusätzliche Gefahr für das Neugeborene oder die Mutter die Gesundheit. Außerdem keine ethischen Bedenken erhoben werden. Der UC wird von einer Vene und zwei Arterien, von denen beide Endothelzellen (ECs) zusammen
Protocol
- Arterien sind von UC Stücke von 3-7 cm erreicht.
- Wharton Sulze, dass die Arterien umgibt wurde sorgfältig durch Schneiden mit der Schere entfernt.
- A blunt-end Nadel aus einem äußeren Durchmesser von 0,6-1mm war ca. 7mm von einem Ende des seziert Arterien eingesetzt.
- So entfernen Sie das verbleibende Blut in den Gefäßen sind die Arterien senkrecht gehalten und perfundierten mit etwa 20 bis 40 mL, physiologischer Kochsalzlösung (PSS), mit einem 20-ml-Spritze verbunden mit einer Nadel. Wenn nötig, wurde dieser Waschschritt für mehrere Male wiederholt.
- Das gleiche Verfahren wurde wiederholt mit RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt.
- Ein Ende des Blutgefäßes geschlossen wurde. Ein 10-ml-Spritze wurde mit der Nadel verbunden und perfundierten mit 3 ml Kollagenase Typ I (800 Einheiten / ml in gepufferten Salzlösung Hanks Solution (HBSS)). Dann werden die anderen extremityof das Schiff war ebenfalls geschlossen.
- Das Schiff wurde inkubiert mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 15 min bei 37 ° C unter Rühren.
- Nach dem Ende des Schiffes wurden geschnitten, um den freien SMCs sammeln. Die Arterien wurden perfuse mit etwa 20 bis 40 ml DMEM-F12 mit 5% FBS und Antibiotika, um eine 50-ml-Röhrchen ergänzt.
- Das Rohr wurde bei Raumtemperatur (250 g, 8 min) zentrifugiert und Zellpellet wurde in 5 ml DMEM-F12 mit 5% FBS resuspendiert.
- Die Zellsuspension wurde zu einer Kollagen-beschichteten T-Kolben überführt und bei 37 ° C unter einer 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
- Nach 5 16 h, die nicht haftenden Zellen und zelluläre drebis wurden entfernt, 5 ml Kulturmedium zugegeben und die Zellen wurden bei 37 ° C unter einer 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
- Die Zellkulturmedien wurde alle 2 3 Tage, bis SMCs Konfluenz erreichten.
- Nachdem die Zellen erreicht Zusammenfluss wurden sie in zwei oder drei 25 cm 2 T-Flaschen ausgesät.
Cleanup
- Entsorgen von Nadeln in Sharps Container.
- Entsorgen von Spritzen in großen Behälter für biologischen.
- Legen Sie alle Gewebe in einen kleinen Beutel für biologisches Risikomaterial. Schließen Sie die Tasche und bei -20 ° Celsius bis Verbrennung.
- Weichen Sie alle Instrumente in viruzid für mindestens 10 min.
- Nicht verwendete Medien Kühlschrank.
- Entsorgen von Handschuhen in biohazard Abfall.
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Discussion
Die SMC kann als Modell für zukünftige Tests mit constrictor Drogen verwendet werden, zu isolieren und strukturell charakterisieren L-Typ Calcium-Kanälen, um zelluläre und molekulare Aspekte der vaskulären Funktion zu untersuchen und sie in das Tissue Engineering verwenden. SMCs und ECs sind für die Entwicklung von neuen Biomaterialien, die in die Produktion von Halbzeugen synthetische Blutgefäße beim Menschen eingesetzt werden eingesetzt werden können fundamental.
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Acknowledgments
Krankenhaus Amato Lusitano, Castelo Branco Portugal.
Krankenhaus Sousa Martins, Guarda Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
