Summary
臍帯は、異なる方法で平滑筋細胞を単離するために使用されています。本研究では孤立した平滑筋細胞への酵素処理を使用していました。
Abstract
ヒト臍帯（UC）は容易にちょうど出産後に得られる生物学的サンプルです。この生物学的サンプルは、、ほとんどの時間です。破棄され、彼らのコレクションは、新生児や母親の健康への追加リスクを意味するものではありません。さらには倫理的な問題は発生しません。 UCは、1つの静脈との両方から内皮細胞（ECS）は、2つの動脈によって構成されています
Protocol
- 動脈は、3〜7センチメートルのUC片から得られる。
- 動脈を囲むウォートンのゼリーは、慎重にハサミでそれを切断して除去した。
- 0.6〜1ミリメートルの外径の平滑末端針を摘出動脈の一方の端より7mm程度に挿入した。
- 血管内に残った血液を削除するには、動脈を垂直に保持し、約20〜40mLを、生理食塩水（PSS）で灌流し、針に接続して20 mLの注射器を使用しています。必要に応じて、この洗浄工程を数回繰り返した。
- 同じ手順は、ウシ胎児血清（FBS）の10％を添加したRPMI 1640を使用して繰り返した。
- 血管のいずれかの先端が閉じられました。 10 mLの注射器を針に接続し、コラゲナーゼI型（ハンクのバッファ塩溶液（HBSS）で800単位/ mL）の3mLで灌流した。その後、他のextremityof容器も閉鎖された。
- 容器を37℃で15分間撹拌しながらCのために、生理食塩水（PBS）をリン酸緩衝インキュベートした。
- 後は容器の端部は自由な平滑筋細胞を収集するように切り出した。動脈は5 FBSの％と50 mLの試験管に抗生物質を添加したDMEM - F12の約20〜40mlで散らすいた。
- チューブは、室温（250グラム、8分）で遠心分離し、細胞ペレットは、FBSの5％を添加したDMEM - F12 5mLに再懸濁した。
- 細胞懸濁液はT -フラスココラーゲンコートに移し、37℃でインキュベートしたC、5％CO 2の加湿雰囲気下で。
- 5 16時間、非接着細胞と細胞のdrebisが削除された後、37℃で培養液を5 mLを添加し、細胞をインキュベートした° C、5％CO 2の加湿雰囲気下で。
- 平滑筋細胞がコンフルエントに達するまで細胞培養培地は、2 3日ごとに変更されました。
- 細胞がコンフルエントに達した後、彼らは、2個または3個の25cm 2の T -フラスコに播種した。
クリーン
- 鋭利物容器の中に針を廃棄してください。
- ビッグバイオハザード容器に注射器を廃棄してください。
- 小さなバイオハザードバッグにすべての組織を置く。 -20袋と凍結を閉まるべき焼却までの摂氏。
- 少なくとも10分間ヴァイラサイドゥですべての楽器を浸す。
- 冷蔵庫に未使用のメディアを返します。
- バイオハザード廃棄物の手袋を廃棄してください。
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Discussion
SMCは、血管機能の細胞および分子的側面を研究し、組織工学でそれらを使用するために、分離と構造的にL型カルシウムチャネルを特徴づけるために、収縮薬との将来のアッセイのためのモデルとして使用することができます。平滑筋細胞と内皮はヒトで使用される半合成血管の生産に使用できる新しいバイオマテリアルの開発のための基本です。
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Acknowledgments
病院アマートルージターノ、カステロブランコポルトガル。
病院スーザマルティンス、グアルダポルトガル。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
