Summary
فالتجهيزات داخل الرغامى تسليم المواد المذابة مباشرة إلى الرئتين. هذا الإجراء يستهدف تسليم instillate في المناطق البعيدة من الرئة ، وبالتالي فإنه غالبا ما تدرج في الدراسات الرامية إلى دراسة الحويصلات الهوائية. ونحن نقدم بروتوكول بقاء مفصلة عن أداء فالتجهيزات داخل الرغامى في الفئران.
Abstract
فالتجهيزات داخل الرغامى تسليم المواد المذابة مباشرة إلى الرئتين. هذا الإجراء يستهدف تسليم instillate في المناطق البعيدة من الرئة ، وبالتالي فإنه غالبا ما تدرج في الدراسات الرامية إلى دراسة الحويصلات الهوائية. ونحن نقدم بروتوكول بقاء مفصلة عن أداء فالتجهيزات داخل الرغامى في الفئران. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء أن الهدف إيصال المواد المذابة اختبار أو المواد الصلبة (مثل علاجات سرطان الرئة والسطحي ، والفيروسات ، و[أليغنوكليوتيد] صغيرة) في الرئة القاصي. فالتجهيزات القصبة الهوائية قد تكون المنهجية المفضلة ، عبر بروتوكولات استنشاق التي قد تستهدف في المقام الأول السبيل التنفسي العلوي ، وربما يعرض المحقق لمواد خطرة. بالإضافة إلى ذلك ، في استخدام بروتوكول تقطير القصبة الهوائية ، يمكن أن يتعافى تماما من الحيوانات الإجراء غير الغازية. وهذا يسمح لجعل القياسات الفسيولوجية لاحقة على حيوانات التجربة ، أو إعادة استخدام نفس الحيوان. يجب أن تكون كمية instillate الرئة التي أدخلت على تحديد دقيق ومتوازن لضمان استرداد osmotically الحيوانية. عادة ، يمكن عرض حجم 30-75 instillate ميكرولتر في الرئة الماوس.
Protocol
1. خدر
- قد التخدير الفئران مع isoflurane تسهيل التعامل مع الحيوانات وضبط النفس قبل بالإدارة intraperitaneally التخدير. قد باستخدام التخدير بالاستنشاق أو قد لا تكون مناسبة لإجراء دراسة خاصة : أولا تحديد تأثير استخدام isoflurane ، أو أي مخدر آخر ، على دراسة المقترح الرئة.
- تخدير الحيوانات مع isoflurane. شريط فيديو يظهر استخدام حجرة المرذاذ isoflurane وضعت في 2 ٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين. إذا لم يكن لديك غرفة isoflurane ، يمكنك استخدام التقنيات القياسية بدلا من التعرض مفتوح قطرة. أرفق الفئران في جرة الجرس (أو مناسبة أخرى غير المسامية الحاوية) مع شبكة سلكية مزودة الى القاع. إلى الشاش وضعت تحت سلكية ، وتطبيق مزيج من 30 ٪ V / V isoflurane في بروبيلين غليكول. استخدام شبكة يضمن أن الحيوان لا تتلامس مع لوحة isoflurane غارقة ، والذي يمكن أن يسبب تهيج الجلد وزيادة الجرعة المحتملة. بعد التعرض لisoflurane قصيرة ، يجب أن يكون تخدير الحيوانات وانهم لن يستجيبوا مع المنعكس المقوم الجرة عندما يميل وانهم لن يستجيبوا بعد قرصة أخمص قدميه.
- مزيد من رصانة الفئران مع الحقن داخل الصفاق من خليط من زيلازين والكيتامين. (ومن الممارسات الجيدة عند إجراء عمليات الحقن داخل الصفاق إلى التراجع للتأكد من أن أجزاء من الأمعاء أو غيرها من الأجهزة الحيوية في الجسم لم يتم اختراقها). مزيج 150 زيلازين ميكرولتر (100 ملغ / مل) مع 1000 الكيتامين ميكرولتر (100 ملغ / مل) في 8850 ميكرولتر من الفوسفات بنسبة 0.9 ٪ معقمة مخزنة المالحة (PBS). بالنسبة للفئران ، وسوف تكون جرعة ما يقرب من 80 جرام لكل 10 ميكرولتر من وزن الجسم. فإن تركيزات النهائي يكون 10 ملغ / كلغ و 100 زيلازين الكيتامين ملغ / كلغ. يجب أن تبقى هذه الحيوانات الجافة ومعزول لمنع فقدان المفرط للحرارة الجسم. ويمكن تطبيق المرهم العيني للعيون لمنع جفاف قرنية العين.
2. إعداد المنطقة الجراحية
- حلق المنطقة حيث سيتم إجراء شق جراحي يمنع التلوث من غير هيأهم المجالات. الحلاقة الكهربائية يمكن أن يحلق خارج عن كثب الفراء الحيوان. يجب أن تكون أكبر منطقة حلق من موقع شق.
- طلب لاحق من كريم إزالة الشعر ، مثل نير ، وسوف تزيل جميع الفراء المتبقية. تطبيق طبقة سميكة من كريم إزالة الشعر لمنطقة الجراحية وتترك لمدة 3 دقائق. يمسح الفراء وكريم إزالة الشعر بمنشفة مبللة. لا تترك كريم إزالة الشعر على ما يزيد عن 10 دقائق.
- تعاطي الكحول 70 ٪ ، أو حل بديل فرك ، لإعداد جو معقم و مطهر المنطقة الجراحية.
3. الإجراءات الجراحية
- موقف تخدير الحيوانات على متن الجراحية منحدر ، أو الوقوف الزاوية زجرية.
- إجراء شق صغير بالقرب من الجانب الأمامي من الرقبة (منطقة الحلق).
- تشريح بعيدا الجلدية للعنق وعضلات القصبة الهوائية الأمامية من أجل الوصول إلى تصور وحلقات القصبة الهوائية.
- عادة كميات الحقن داخل الرغامى هي 3 جرام لكل ميكرولتر من وزنه (حوالي 30-75 الحجم النهائي ميكرولتر). إدارة المقدار المناسب من تحت الجلد باستخدام instillate 1mL (دون - Q) المحاقن مع قياس 30 ، 5/16-inch الإبرة. عقد الجانب شطبة حقنة صعودا وبالتوازي مع القصبة الهوائية ، وحقن حجم الكامل instillate في القصبة الهوائية.
- قد يجيب الحيوان يلهث بعد تقطير من المذاب في الرئتين. وإدخال الهواء من خلال حقنة ومراقبة ما إذا كان توسيع الرئتين تؤكد أيضا تقنيات التنبيب ناجحة.
- إزالة المحقنة من القصبة الهوائية.
4. الغرز.
- فهم أرجح الإبرة (الجزء سمكا من الإبرة حيث تعلق مواد خياطة الجروح) مع حامل الإبرة.
- تخترق الجلد مع غيض من إبرة في زاوية 90 ملم حوالي 1-3 ° بعيدا عن حافة الجرح ، اعتمادا على سماكة الجلد. فهم الإبرة تغادرها بعد مرور واحد عبر النسيج. وغرز بسيطة ، معقود على حدة ، على مقربة بكفاءة الجرح.
5. الحيوان الاسترداد
- وينبغي أن الحيوانات يشفون تماما من التخدير والعملية الجراحية بعد 3-24 ساعات.
6. ممثل النتائج
تستيل داخل الرغامى مجمع الفلورسنت ، Cy5.5 مترافق لديكستران ، ويظهر تقطير ناجحة لمجمع الفلورية في الرئة الماوس B6 (الشكل 1). ويستهدف في المقام الأول على صبغة الفلورسنت لالرئة ويتم توزيعها بالتساوي. إشارة الفلورسنت في القناة الهضمية على الفور باتباع الإجراء تشير إلى أنه تم عن غير قصد intubated المريء خلال الداخلي (الشكل 2). يمكن للمحققين أيضا التحقق من التسليم الموجه للمركبات في الرئة ، والتحقق من توزيع instillate ، وبعد إجراء خلال تضخيم الرئتين ، وإعداد شرائح أنسجة الرئة (2 ، 3) أو histolo الثابتةعينات gical.
الشكل 1. نيون Cy5.5 إشارة شارك في تسجيل مع صورة الأشعة السينية في الرئة الماوس غرست بنجاح. وقد غرست 1،4 ملغ Cy5.5 ديكستران (عند تركيز 10 ميكروغرام / ميكرولتر) في القصبة الهوائية للرئة الفأر B6. تم الكشف عن Cy5.5 إشارة باستخدام الإثارة نانومتر 675 مرشح ومرشح الانبعاثات نانومتر 695.
الشكل 2. المشارك تسجيل إشارة الفلورسنت أظهرت الأشعة السينية مع تراكب في الماوس غرست سيئة. غير ملائم التنبيب من خلال القصبة الهوائية والمريء نتائج بروتوكول تقطير في Cy5.5 التسليم إلى الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت فالتجهيزات داخل الرغامى في عدة دراسات مختلفة لتقييم سمية اختبار المركبات (6) ، وحمل السنخية إصابة الرئة (4 و 7) ، يستعاض عن السطحي (8) ، فضلا عن تغير التعبير الجيني عن طريق تسليم [أليغنوكليوتيد] صغيرة مباشرة في الرئة (5). نحن نبحث حاليا استخدام غرس 1) الفلورسنت الأكسدة مواد حساسة في الرئة وذلك لقياس الاكسدة في الجسم الحي في ظل الظروف العادية والمرضية في جسم المريض ، وكذلك 2) غرس المؤشرات الفلورسنت مع المركبات الدوائية ، وناقلات الحمض النووي ، والفيروسات ، و / أو microRNA لتقييم تأثير كل instillate على نقل السوائل في الرئة.
هناك مزايا عديدة لإدخال المواد الأجنبية في الرئة باستخدام بروتوكول تقطير خلال استنشاق (إعادة النظر في (1)). الفوائد الرئيسية من استخدام بروتوكول تقطير تشمل التعرض لمركبات الحد ، مسرطنة سامة أو مشعة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إدخال المواد الصلبة وكذلك المواد السائلة ، في الرئة. يمكن القول ، وأكبر عيب في استخدام نهج تقطير القصبة الهوائية هو أن إدخال instillate غير الغازية وnonphysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وK99 HL09222601 S & R مؤسسة جائزة منحت لUneo Ryaji MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
