Summary
Intratracheal instillations सीधे फेफड़ों में विलेय उद्धार. इस प्रक्रिया में फेफड़ों के बाहर का क्षेत्रों में instillate की डिलीवरी लक्ष्य है, और इसलिए अक्सर अलवियोली अध्ययन करने के उद्देश्य से अध्ययन में शामिल है. हम चूहों में intratracheal instillations प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत अस्तित्व प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Abstract
Intratracheal instillations सीधे फेफड़ों में विलेय उद्धार. इस प्रक्रिया में फेफड़ों के बाहर का क्षेत्रों में instillate की डिलीवरी लक्ष्य है, और इसलिए अक्सर अलवियोली अध्ययन करने के उद्देश्य से अध्ययन में शामिल है. हम चूहों में intratracheal instillations प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत अस्तित्व प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, एक बाहर का फेफड़ों में विलेय या ठोस परीक्षण (जैसे फेफड़ों चिकित्सा, surfactants, वायरस, और छोटे oligonucleotides) की डिलीवरी लक्षित कर सकते हैं. Tracheal instillations पसंदीदा पद्धति साँस लेना प्रोटोकॉल है कि मुख्य रूप से ऊपरी श्वास पथ के लक्ष्य सकता है और संभवतः संभावित खतरनाक पदार्थों के लिए अन्वेषक बेनकाब हो सकता है. इसके अतिरिक्त, tracheal टपकाना प्रोटोकॉल का प्रयोग करने में, जानवरों गैर इनवेसिव प्रक्रिया से पूरी तरह ठीक हो सकता है. यह परीक्षण पशुओं, या पुनर्स्थापना वही जानवर का उपयोग पर बाद शारीरिक माप बनाने के लिए अनुमति देता है. फेफड़ों में पेश instillate की राशि को ध्यान से और निर्धारित चाहिए osmotically जानवरों की वसूली सुनिश्चित करने के लिए संतुलित. आमतौर पर 30-75 μL instillate मात्रा माउस फेफड़ों में पेश किया जा सकता है है.
Protocol
1. बेहोशी
- Isoflurane साथ चूहों Anesthetizing संज्ञाहरण intraperitaneally प्रशासन जानवर से निपटने और संयम से पहले सुविधा हो सकती है. एक साँस चतनाशून्य करनेवाली औषधि का प्रयोग हो सकता है या हो सकता है एक विशेष रूप से अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं: पहले isoflurane का उपयोग करने का प्रभाव है, या किसी भी अन्य संवेदनाहारी प्रस्तावित फेफड़ों के अध्ययन पर निर्धारित.
- Isoflurane के साथ जानवरों anesthetize. वीडियो एक isoflurane vaporizer isoflurane 2% पर सेट चैम्बर ऑक्सीजन के साथ मिश्रित का उपयोग दिखाता है. यदि आप एक isoflurane चैम्बर नहीं है, तो आप वैकल्पिक मानक खुले ड्रॉप जोखिम तकनीक का उपयोग कर सकते हैं. नीचे फिट एक तार जाल के साथ एक घंटी जार में चूहों (या अन्य उपयुक्त गैर झरझरा कंटेनर) बंद करें. एक धुंध तार की जाली के नीचे रखा पैड करने के लिए, 30% v / v propylene glycol में isoflurane का एक मिश्रण लागू होते हैं. मेष का उपयोग सुनिश्चित करता है कि पशु isoflurane से लथपथ पैड है, जो त्वचा में जलन और संभावित overdosing का कारण सकता है के साथ संपर्क में नहीं आया है. Isoflurane करने के लिए कम जोखिम के बाद, पशु anesthetized हो सकता है और जवाब जब जार इत्तला दे दी है और पैर के अंगूठे चुटकी के बाद जवाब नहीं होगा एक ठीक पलटा साथ नहीं होगा चाहिए.
- अंतर peritoneal Xylazine और Ketamine के मिश्रण का एक इंजेक्शन के साथ इसके अलावा शांत चूहों. (यह अच्छा अभ्यास है जब intraperitoneal इंजेक्शन वापस आकर्षित करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि पेट या अन्य महत्वपूर्ण अंगों के भागों को penetrated नहीं किया गया है प्रदर्शन) है. 1000 μL 8850 में 0.9% की बाँझ फॉस्फेट के μL Ketamine (100 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 150 μL Xylazine (100 मिलीग्राम / एमएल) मिक्स खारा buffered (पीबीएस). चूहों के लिए, खुराक शरीर के वजन के 10 ग्राम प्रति लगभग 80 μL जाएगा. अंतिम सांद्रता 10 मिलीग्राम / किलोग्राम Xylazine और 100 मिलीग्राम / किलोग्राम Ketamine जाएगा. जानवरों सूखी रखा जाना चाहिए और शरीर की गर्मी के अत्यधिक हानि को रोकने के लिए अछूता. नेत्र मरहम आंखों को लागू किया जा सकता है corneas के सूखने से रोकने के.
2. सर्जिकल क्षेत्र की तैयारी
- शेविंग क्षेत्र है जहां शल्य चीरा किया जाएगा गैर prepped क्षेत्रों से संक्रमण से बचाता है. एक बिजली के रेजर निकट पशु बंद फर दाढ़ी कर सकते हैं. मुंडा क्षेत्र चीरा साइट से बड़ा होना चाहिए.
- ऐसे नायर के रूप में में बाल हटाने क्रीम, के बाद आवेदन, सभी शेष फर निकाल देंगे. शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए बालों को हटाने क्रीम की मोटी परत लागू करें और 3 मिनट के लिए छोड़ दें. दूर और एक नम तौलिया के साथ बालों को हटाने क्रीम फर साफ कर लें. पर 10 मिनट से अधिक में बालों को हटाने क्रीम मत छोड़ो.
- 70% शराब, या एक वैकल्पिक साफ़ समाधान का उपयोग करें, aseptically शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार.
3. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया
- एक sloped शल्य चिकित्सा बोर्ड, या angled निरोधक स्टैंड पर anesthetized जानवरों की स्थिति.
- गर्दन के पूर्वकाल पहलू (गले क्षेत्र) के पास एक छोटा सा चीरा बनाओ.
- दूर platysma और पूर्वकाल tracheal मांसपेशियों काटना क्रम में करने के लिए कल्पना और tracheal छल्ले का उपयोग.
- आमतौर पर, intratracheal इंजेक्शन की मात्रा वजन के 3 μl प्रति ग्राम (30-75 लगभग μL अंतिम मात्रा) हैं. Instillate की उचित मात्रा में एक 1ml उपचर्म (उप - क्यू) के एक 30 गेज, 5/16-inch सुई के साथ सिरिंज का उपयोग प्रशासन. सिरिंज बेवल पक्ष पकड़ो और समानांतर ट्रेकिआ के साथ, और ट्रेकिआ में instillate की पूरी मात्रा इंजेक्षन.
- पशु फेफड़ों में घुला हुआ पदार्थ के टपकाना के बाद हांफते द्वारा जवाब हो सकता है. सिरिंज के माध्यम से हवा का परिचय और देख कि क्या फेफड़ों का विस्तार भी सफल इंटुबैषेण तकनीक की पुष्टि करेगा.
- ट्रेकिआ से सिरिंज निकालें.
4. Sutures.
- मुट्ठी एक सुई धारक के साथ सुई का एक प्रकार का ठप्पा (सुई जहां सिवनी सामग्री जुड़ा हुआ है की बड़ी से बड़ी भाग).
- एक 90 ° कोण लगभग 1-3 मिमी में सुई के घाव के किनारे से दूर टिप, त्वचा की मोटाई पर निर्भर करता है के साथ त्वचा घुसना. ऊतक के माध्यम से एक पास के बाद बाहर निकलने सुई समझ. सरल टांके, व्यक्तिगत knotted, कुशलता घाव बंद हो जाएगा.
5. पशु रिकवरी
- पशु संज्ञाहरण और 3-24 घंटे के बाद शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया से पूरी तरह उबरने चाहिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
फ्लोरोसेंट परिसर के Intratracheal टपकाना, Cy5.5 dextran संयुग्मित, बी -6 माउस फेफड़ों में फ्लोरोसेंट यौगिक (चित्रा 1) के सफल टपकाना से पता चलता है. फ्लोरोसेंट रंजक मुख्य रूप से फेफड़ों को लक्षित किया जाता है और समान रूप से वितरित है. तुरंत प्रक्रिया के बाद जठरांत्र संबंधी मार्ग में प्रतिदीप्त संकेत यह इंगित करता है कि घुटकी अनजाने प्रक्रिया (चित्रा 2) के दौरान intubated किया गया था. जांचकर्ता भी फेफड़ों में यौगिकों के लक्षित वितरण की पुष्टि कर सकते हैं और instillate के वितरण की जांच करने के लिए, फेफड़ों inflating और फेफड़े के ऊतकों (2, 3) स्लाइस की तैयारी प्रक्रिया के बाद या तय histological नमूने.
चित्रा 1 प्रतिदीप्त. Cy5.5 संकेत सह सफलतापूर्वक डाले माउस फेफड़ों में एक्स - रे छवि के साथ पंजीकृत है. 1.4 मिलीग्राम Cy5.5 Dextran (10 μg / μL के एक एकाग्रता में) बी -6 माउस फेफड़ों के ट्रेकिआ में डाले था. Cy5.5 संकेत एक 675 एनएम उत्तेजना फिल्टर और एक 695 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर पाया था.
चित्रा 2 फ्लोरोसेंट खराब डाले माउस में एक्स - रे उपरिशायी के साथ दिखाया संकेत के सह पंजीकरण . घुटकी के tracheal Cy5.5 आंतों के लिए प्रसव में टपकाना प्रोटोकॉल परिणाम के दौरान अनुचित इंटुबैषेण.
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Discussion
Intratracheal instillations कई विभिन्न अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है परीक्षण यौगिकों (6) की विषाक्तता का मूल्यांकन करने, वायुकोशीय फेफड़ों की चोट (4, 7) प्रेरित, छोटे oligonucleotides की डिलीवरी के माध्यम से surfactants, (8) के रूप में अच्छी तरह से बदल जीन अभिव्यक्ति की जगह सीधे में फेफड़ों (5). वर्तमान में हम एक instilling के उपयोग की खोज कर रहे हैं) फेफड़ों में फ्लोरोसेंट redox के प्रति संवेदनशील सामग्री के क्रम में vivo में सामान्य और pathophysiological शर्तों के तहत oxidative तनाव को मापने के रूप में 2 के रूप में में अच्छी तरह से) औषधीय यौगिकों, डीएनए वैक्टर, वायरस, और के साथ फ्लोरोसेंट संकेतक instilling / या फेफड़ों के तरल पदार्थ परिवहन पर प्रत्येक instillate के प्रभाव का आकलन करने के लिए microRNA.
फेफड़ों में विदेशी सामग्री शुरू साँस लेना जोखिम ((1) में समीक्षा) पर एक टपकाना प्रोटोकॉल का उपयोग करने के कई फायदे हैं. एक टपकाना प्रोटोकॉल का उपयोग करने का प्राथमिक लाभ विषाक्त, कैंसर, या रेडियोधर्मी यौगिकों के लिए जोखिम सीमित शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तरल पदार्थ ठोस, फेफड़ों में पेश किया जा सकता है है. बेशक, tracheal टपकाना दृष्टिकोण का उपयोग कर करने के लिए सबसे बड़ा दोष यह है कि instillate की शुरूआत आक्रामक और nonphysiological है.
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Acknowledgments
इस काम के द्वारा समर्थित K99 HL09222601 NIH और एस एंड आर फाउंडेशन Ryaji Uneo MNH के लिए पुरस्कार से सम्मानित किया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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