Summary
Intratracheale instillaties leveren opgeloste stoffen direct in de longen. Deze procedure richt zich op de levering van de instillate in het distale gebieden van de long, en is daarom vaak opgenomen in studies gericht op het bestuderen van longblaasjes. Wij bieden een uitgebreide survival protocol voor het uitvoeren van intratracheale instillaties bij muizen.
Abstract
Intratracheale instillaties leveren opgeloste stoffen direct in de longen. Deze procedure richt zich op de levering van de instillate in het distale gebieden van de long, en is daarom vaak opgenomen in studies gericht op het bestuderen van longblaasjes. Wij bieden een uitgebreide survival protocol voor het uitvoeren van intratracheale instillaties bij muizen. Met behulp van deze aanpak, kan men de levering van test-opgeloste stoffen of vaste stoffen (zoals long-therapeutica, oppervlakteactieve stoffen, virussen, en kleine oligonucleotiden) te richten op de distale long. Tracheale instillaties kan de voorkeur methodiek worden, na inhalatie-protocollen die in de eerste plaats kunnen richten op de bovenste luchtwegen en eventueel de onderzoeker bloot aan potentieel gevaarlijke stoffen. Bovendien, het gebruik van de tracheale instillatie protocol, kunnen dieren volledig te herstellen van de niet-invasieve procedure. Dit maakt voor het maken van de volgende fysiologische metingen op proefdieren, of opnieuw installeren met behulp van hetzelfde dier. De hoeveelheid instillate geïntroduceerd in de longen moet zorgvuldig worden bepaald en osmotisch evenwicht van dieren herstel te verzekeren. Meestal kan 30 tot 75 pi instillate volume worden opgenomen in de muis long.
Protocol
1. Anesthesie
- Verlamming muizen met isofluraan kunnen vergemakkelijken dier behandeling en terughoudendheid vóór het toedienen van anesthesie intraperitaneally. Met behulp van een geïnhaleerd verdoving kan wel of niet geschikt zijn voor een bepaalde studie: bepaal eerst de invloed van het gebruik van isofluraan, of enige andere verdoving, over het voorgestelde longen te bestuderen.
- Verdoven dieren met isofluraan. De video toont het gebruik van een vaporizer isofluraan kamer vastgesteld op 2% isofluraan gemengd met zuurstof. Als u niet beschikt over een isofluraan kamer, kunt u als alternatief gebruik van standaard open-drop exposure technieken. Voeg ratten in een glazen stolp (of andere geschikte niet-poreuze container) met een gaas aangebracht op de bodem. Om een gaasje geplaatst onder het gaas, breng dan een mengsel van 30% v / v isofluraan bij propyleenglycol. Het gebruik van het gaas zorgt ervoor dat het dier niet in contact komen met de isofluraan gedrenkte pad, die de huid irritatie en mogelijke overdosering kunnen veroorzaken. Na een korte blootstelling aan isofluraan, moet het dier onder narcose en zal niet reageren met een oprichtende reflex wanneer de pot wordt getipt en zal niet reageren na teen knijpen.
- Verder rustig muizen met een intra-peritoneale injectie van een mix van Xylazine en ketamine. (Het is een goede gewoonte bij het uitvoeren van intraperitoneale injecties om terug te trekken om te verzekeren dat delen van de darm of andere vitale organen niet zijn doorgedrongen). Mix 150 pi Xylazine (100 mg / ml) met 1000 pi ketamine (100 mg / ml) in 8850 pi van 0,9% steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voor muizen, zal de dosering worden ongeveer 80 pl per 10 g van het lichaamsgewicht. De uiteindelijke concentraties van 10 mg / kg Xylazine en 100 mg / kg ketamine worden. De dieren moeten worden gehouden droog en geïsoleerd om overmatig verlies van lichaamswarmte te voorkomen. Oogzalf kan worden toegepast op de ogen om te voorkomen dat het drogen van de hoornvliezen.
2. Voorbereiding van de chirurgische gebied
- Het scheren van de ruimte waar de incisie wordt gemaakt voorkomt besmetting van niet-geprepareerde gebieden. Een elektrisch scheerapparaat kan de vacht goed afscheren van het dier. Het geschoren gebied moet groter zijn dan de incisie site.
- Verdere toepassing van ontharingscrème, zoals Nair, verwijdert alle resterende vacht. Breng een dikke laag van ontharing crème op de chirurgische gebied en laat gedurende 3 minuten. Veeg de vacht en de ontharingscrème met een vochtige handdoek. Laat de ontharingscrème op van meer dan 10 minuten.
- Gebruik 70% alcohol, of een alternatief scrub oplossing voor aseptisch bereiden de chirurgische gebied.
3. Chirurgische Procedure
- Plaats de verdoofde dier op een hellend chirurgische bord, of hoekige remmende stand.
- Maak een kleine incisie in de buurt van de voorzijde van de hals (keel).
- Ontleden weg platysma en de voorste tracheale spieren om te visualiseren en toegang tot de tracheale ringen.
- Typisch, intratracheale injectie volumes zijn 3 ul per gram gewicht (ongeveer 30 tot 75 pi eindvolume). Dien de juiste hoeveelheid van instillate met behulp van een 1 ml subcutane (sub-Q) spuit met een 30 gauge, 5/16-inch naald. Houd de spuit schuine zijde naar boven en parallel met de luchtpijp, en injecteer het volledige volume van instillate in de luchtpijp.
- Het dier kan reageren door hijgend na de instillatie van opgeloste stof in de longen. Het inbrengen van lucht door middel van de spuit en het observeren van de vraag of de longen uit te breiden is ook een bevestiging succesvolle intubatie technieken.
- Verwijder spuit uit de luchtpijp.
4. Hechtingen.
- Pak de naald swage (dikste gedeelte van de naald waar het hechtmateriaal is bevestigd) met een naald houder.
- De huid met de punt van de naald onder een hoek van 90 ° ongeveer 1-3 mm afstand van de rand van de wond, afhankelijk van de dikte van de huid. Pak de naald na het verlaten van een door het weefsel. Eenvoudige steken, individueel geknoopt, zal efficiënt sluit de wond.
5. Dier Recovery
- Dieren moeten volledig te herstellen van de anesthesie en de chirurgische procedure na 3-24 uur.
6. Representatieve resultaten
Intratracheale instillatie van fluorescente verbinding, Cy5.5 geconjugeerd aan dextran, blijkt succesvolle instillatie van fluorescerende verbinding in B6 muizen long (figuur 1). De fluorescente kleurstof is in de eerste plaats gericht op de longen en is gelijkmatig verdeeld. TL-signaal in het maag-darmkanaal onmiddellijk na de procedure geeft aan dat de slokdarm per ongeluk werd geïntubeerd tijdens de procedure (figuur 2). Onderzoekers kunnen ook controleren of gerichte toediening van stoffen in de longen, en controleer de verdeling van de instillate, volgens de procedure door het opblazen van de longen en het voorbereiden van longweefsel plakjes (2, 3) of vaste histologische monsters.
Figuur 1. Fluorescent Cy5.5 signaal co-geregistreerde met X-ray beeld in het succesvol ingedruppeld muis long. 1,4 mg Cy5.5 Dextraan (bij een concentratie van 10 ug / pi) werd ingeprent in de luchtpijp van de B6 muis long. Cy5.5 signaal werd gedetecteerd met behulp van een 675 nm excitatie-filter en een 695 nm emissie-filter.
Figuur 2. Co-registratie van fluorescent signaal getoond met X-ray overlay in slecht bijgebracht muis. Ongepast intubatie van de slokdarm tijdens tracheale instillatie protocol resulteert in een Cy5.5 levering aan de darmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratracheale instillaties zijn gebruikt in een aantal verschillende studies naar de toxiciteit van stoffen te testen (6) te evalueren, alveolaire longbeschadiging (4, 7) te induceren, oppervlakte-actieve stoffen (8), evenals alter genexpressie direct te vervangen door de levering van kleine oligonucleotiden in de long (5). We zijn momenteel het verkennen van het gebruik van de bevolking is 1) TL-redox-gevoelig materiaal in de longen om oxidatieve stress te meten in vivo onder normale en pathofysiologische omstandigheden, evenals 2) bijbrengen fluorescerende indicatoren met farmacologische stoffen, DNA-vectoren, virussen en / of microRNA om het effect van elke instillate op longvocht vervoer te beoordelen.
Er zijn verschillende voordelen van de invoering van vreemde stoffen in de longen met behulp van een protocol over het inbrengen inademing (beoordeeld in (1)). De belangrijkste voordelen van het gebruik van een toediening protocol omvat het beperken van de blootstelling aan giftige, kankerverwekkende, of radioactieve stoffen. Daarnaast kunnen vaste stoffen als vloeibaar materiaal, geïntroduceerd worden in de longen. Ongetwijfeld, de grootste nadeel van het gebruik van de tracheale instillatie aanpak is dat de introductie van de instillate is invasief en nonphysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH K99 HL09222601 en de S & R Foundation Ryaji Uneo Award uitgereikt aan MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
