Summary
Intratrakeal instilasyonlar doğrudan ciğerlerine çözünenlerin sağlar. Bu prosedür, akciğer distal bölgeye instillate teslim hedefler ve bu nedenle sık sık alveoller okuyan yönelik çalışmalar dahil edilmiştir. Biz farelerde intratrakeal instilasyonlar gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yaşam protokolü sağlar.
Abstract
Intratrakeal instilasyonlar doğrudan ciğerlerine çözünenlerin sağlar. Bu prosedür, akciğer distal bölgeye instillate teslim hedefler ve bu nedenle sık sık alveoller okuyan yönelik çalışmalar dahil edilmiştir. Biz farelerde intratrakeal instilasyonlar gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yaşam protokolü sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, distal akciğer içine test çözünenlerin veya katı teslim (akciğer terapötikler, yüzey, virüs, ve küçük oligonükleotidler gibi) hedefleyebilir. Trakeal instilasyonlar öncelikle üst solunum yolu hedef ve araştırmacı muhtemelen potansiyel olarak tehlikeli maddelere maruz inhalasyon protokolleri üzerinden tercih edilen bir yöntem olabilir. Ayrıca, trakeal instilasyon protokolünü kullanarak, hayvanlar tamamen non-invaziv kurtarabilirsiniz. Bu aynı hayvan kullanarak test hayvanları, ya da yeniden yükleme sonraki fizyolojik ölçümler yapmak için sağlar. Akciğer içine tanıtıldı instillate miktarı dikkatlice belirlenir ve ozmotik hayvan kurtarma sağlamak için dengeli olmalıdır. Tipik olarak, 30-75 mcL instillate hacmi fare akciğer içine sokulabilir.
Protocol
1. Anestezi
- Izofluran ile fareler anestezi intraperitaneally anestezi yönetmek için önce hayvan taşıma ve tutma kolaylaştırabilir. Inhale anestezik kullanılması veya belirli bir çalışma için uygun olmayabilir olabilir: izofluran kullanarak önerilen akciğer çalışması ilk etkisi, ya da başka herhangi bir anestezi belirlemek.
- Izofluran ile hayvanların anestezisi. Video izofluran az% 2 oksijen ile karışık bir izofluran buharlaştırıcı odası kullanımını gösterir. Izofluran bir odasına yoksa, alternatif standart açık bırak maruz kalma teknikleri kullanarak yapabilirsiniz. Alt takılan bir tel örgü ile bir fanus sıçan (veya diğer uygun olmayan gözenekli bir kap) içine alın. Örgü tel altına yerleştirilen bir gazlı bezle,% 30 v / v izofluran propilen glikol karışımı uygulanır. Mesh kullanımı, hayvan, ciltte tahriş ve potansiyel doz aşımı neden olabilir izofluran bulanmış yüzeyi, temas olmadığını sağlar. Izofluran kısa maruz kaldıktan sonra, hayvanın anestezi olmalı ve kavanoz uçlu ve ayak tutam sonra yanıt vermez doğrulan bir refleksle cevap vermeyecektir.
- Xylazine ve Ketamin bir karışımı bir periton içi enjeksiyon ile daha oturaklı fareler. (Bağırsak bölümlerini veya diğer hayati organlara nüfuz edilmemiş olması sigorta geri çekmek için intraperitoneal yaparken iyi bir uygulamadır.) 150 mcL Xylazine (100 mg / ml)% 0.9 'luk steril fosfat 8850 mcL 1000 mcL Ketamin (100 mg / ml) ile karıştırın tamponlu salin (PBS). Fareler için, doz, vücut ağırlığı 10 gram başına yaklaşık 80 mcL olacaktır. Son konsantrasyonu 10 mg / Kg Xylazine ve 100 mg / kg Ketamin olacaktır. Hayvanların kuru tutulmalı ve aşırı vücut ısı kaybını önlemek için izole edilmelidir. Oftalmik merhem gözleri korneanın kurumasını önlemek için uygulanabilir.
2. Cerrahi Alan hazırlanması
- Cerrahi kesi yapılacaktır alanında Tıraş olmayan prepped alanlarda kirlenmesini önler. Bir elektrikli tıraş makinesi, hayvan yakından kapalı kürk tıraş edebilirsiniz. Traş kesi siteden daha büyük olmalıdır.
- Gibi Nair epilasyon kremi, sonraki uygulama, geriye kalan tüm kürk kaldıracaktır. Cerrahi alanında epilasyon kremi kalın bir tabaka uygulayın ve 3 dakika bekletin. Kürk ve kıl dökücü krem nemli bir havlu ile silin. Tüy dökücü krem, 10 dakikadan fazla bırakmayın.
- Aseptik cerrahi alanı hazırlamak için,% 70 alkol veya alternatif bir fırçalayın çözümü kullanın.
3. Cerrahi Prosedür
- Anestezi hayvan, eğimli bir cerrahi tahta ya da açılı frenleyici stand üzerine yerleştirin.
- Küçük bir kesi boynun ön yüzüne (boğaz bölgesi) yakın olun.
- Trakeal halkalar görselleştirmek ve erişmek için platysma ve anterior trakeal kasları parçalara ayır.
- Tipik olarak, intratrakeal enjeksiyon hacimleri 3 kilo ul başına gram (yaklaşık 30-75 mcL son hacim). Instillate uygun miktarda 1 ml subkutan (alt-Q), 30 gauge, 5/16-inch iğne şırınga kullanarak yönetme. Şırınganın konik tarafı yukarı tutun ve paralel trakea, trakea içine tam instillate hacmi enjekte.
- Hayvan Ciğerlere çözünen instilasyon nefes nefese cevap verebilir. Şırınga hava yoluyla tanıtılması ve akciğerleri genişletmek olmadığını gözlemleyerek de başarılı entübasyon teknikleri onaylamak.
- Trakea şırınga çıkarın.
4. Dikişler.
- Bir iğne tutucu iğne sıkma (dikiş materyaline bağlı olduğu iğne kalın kısım) kavrayın.
- Deri kalınlığına bağlı olarak yara kenarından 90 ° açı yaklaşık 1-3 mm iğne ucu ile deriye nüfuz ederler. Doku üzerinden geçtikten sonra çıkarken iğne kavrayın. Basit dikiş, tek tek düğümlü, verimli bir yara kapanacak.
5. Hayvan Kurtarma
- Hayvanlar 3-24 saat sonra anestezi ve cerrahi prosedür tamamen kurtarmak gerekir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Floresan bileşik intratrakeal instilasyon, dekstran konjuge Cy5.5, B6 fare akciğer floresan bileşik (Şekil 1) başarılı instilasyon gösterir. Floresan boya, öncelikle akciğer hedef ve eşit olarak dağıtılır. Floresan sinyal prosedürü izleyerek hemen gastrointestinal sistem, yemek borusu (Şekil 2) prosedürü sırasında yanlışlıkla entübe olduğunu gösterir. Araştırmacılar ayrıca akciğer içine bileşiklerin hedef teslim doğrulamak ve instillate dağıtımı kontrol edin, akciğerler şişirme ve akciğer dokusunda dilimleri (2, 3) hazırlama prosedürü izleyerek ya da sabit histolojik örnekleri.
Şekil 1 Floresan Cy5.5 sinyal başarıyla aşılamış fare akciğer X-ray görüntü ile birlikte kayıtlı. 1.4 mg Cy5.5 Dextran'ın (10 mg / ml 'lik bir konsantrasyon), B6 fare akciğer trakea içine damlatıldı. 675 nm eksitasyon filtresi ve 695 nm emisyon filtresi kullanarak Cy5.5 sinyal tespit edildi.
Şekil 2 floresan sinyal zayıf aşılamış fare X-ray kaplama ile gösterilir Co-kaydı. Bağırsaklarda Cy5.5 teslim trakeal instilasyon protokol sırasında yemek borusu Uygunsuz entübasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratrakeal instilasyonlar test bileşikler (6) toksisitesini değerlendirmek için çok çeşitli çalışmalar kullanılmış olan alveoler akciğer hasarı (4, 7) neden doğrudan küçük oligonükleotidler teslim yoluyla yüzey (8), gen ekspresyonu gibi değiştirmek yerine akciğer (5). Şu anda akciğer içine floresan redoks duyarlı malzeme farmakolojik bileşikler, DNA vektörleri, virüs, ve floresan göstergeleri instilling) yanı sıra 2 olarak, normal ve patofizyolojik koşullar altında in vivo oksidatif stresi ölçmek için) 1 instilling keşfediyoruz ve / veya akciğer sıvı taşıma her instillate etkisini değerlendirmek microRNA.
Inhalasyon ile maruz kalma ((1) gözden) üzerinde bir instilasyon protokolü kullanarak akciğer içine yabancı madde tanıtan çeşitli avantajları vardır. Instilasyon protokolünü kullanarak birincil faydaları, zehirli, kanserojen, radyoaktif bileşikler sınırlayıcı maruz içerir. Ayrıca, katıların yanı sıra sıvı malzeme, akciğer içine sokulabilir. Muhtemelen, trakeal instilasyon yaklaşım kullanarak en büyük dezavantajı instillate giriş invaziv ve nonphysiological olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, K99 HL09222601 ve MNH verilen S & R Vakfı Ryaji Uneo Ödülü tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
