Summary
Instillations intratrachéale offrir solutés directement dans les poumons. Cette procédure vise la livraison de l'instillation dans les régions distales du poumon, et est donc souvent incorporées dans des études visant à étudier les alvéoles. Nous fournissons un protocole de survie détaillées pour effectuer des instillations intra-trachéale chez les souris.
Abstract
Instillations intratrachéale offrir solutés directement dans les poumons. Cette procédure vise la livraison de l'instillation dans les régions distales du poumon, et est donc souvent incorporées dans des études visant à étudier les alvéoles. Nous fournissons un protocole de survie détaillées pour effectuer des instillations intra-trachéale chez les souris. En utilisant cette approche, on peut cibler la livraison des solutés de test ou des solides (comme les traitements du poumon, tensioactifs, les virus et les oligonucléotides de petite taille) dans le poumon distal. Instillations trachéales peut être la méthode privilégiée, sur les protocoles d'inhalation qui peut ciblent principalement les voies respiratoires supérieures et peut exposer le chercheur à des substances potentiellement dangereuses. En outre, en utilisant le protocole d'instillation trachéale, les animaux peuvent se remettre complètement de la procédure non-invasive. Cela permet de faire suite des mesures physiologiques sur les animaux d'essai, ou à la réinstallation en utilisant le même animal. Le montant de l'instillation introduit dans les poumons doit être soigneusement déterminé et osmotiquement équilibrée pour assurer la récupération des animaux. Typiquement, le volume de 30 à 75 uL instillation peuvent être introduits dans des poumons de souris.
Protocol
1. L'anesthésie
- Anesthésier les souris avec de l'isoflurane peut faciliter la manipulation des animaux et à la retenue avant d'administrer l'anesthésie intraperitaneally. En utilisant un anesthésique par inhalation peut être ou ne pas être approprié pour une étude particulière: d'abord déterminer l'impact de l'utilisation de l'isoflurane, ou tout autre anesthésique, sur l'étude des poumons proposé.
- Anesthetize animaux à l'isoflurane. La vidéo montre l'utilisation d'une chambre d'isoflurane vaporisateur fixé à 2% d'isoflurane mélangé avec l'oxygène. Si vous n'avez pas une chambre de l'isoflurane, vous pouvez également utiliser des techniques standard de l'exposition ouverte à goutte. Joindre des rats dans une cloche de verre (ou d'autres non poreux contenant) avec un grillage monté sur le fond. Pour un tampon de gaze placée sous le treillis métallique, appliquez un mélange de 30% v / v isoflurane dans du propylène glycol. L'utilisation de la maille assure que l'animal ne vienne pas en contact avec le tampon imbibé d'isoflurane, ce qui pourrait causer des irritations de la peau et le surdosage potentiel. Après courte exposition à l'isoflurane, l'animal doit être anesthésié et ne répondra pas à un réflexe de redressement lorsque le pot est incliné et ne répondra pas, après pincement de l'orteil.
- Souris plus calmes avec une injection intra-péritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine. (Il est de bonne pratique lors de la réalisation des injections intrapéritonéales de reculer pour s'assurer que des portions de l'intestin ou d'autres organes vitaux n'ont pas été pénétrés). Mélanger 150 uL xylazine (100 mg / mL) avec 1000 kétamine uL (100 mg / mL) en 8850 uL de phosphate stérile à 0,9% saline tamponnée (PBS). Pour les souris, la dose sera d'environ 80 pi par 10 g de poids corporel. Les concentrations finales sera de 10 mg / kg de xylazine et de 100 mg / kg de kétamine. Les animaux doivent être gardés au sec et isolés pour prévenir la perte excessive de chaleur corporelle. Pommade ophtalmique peut être appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
2. Préparation de la zone chirurgicale
- Rasage de la zone où l'incision chirurgicale sera faite empêche la contamination de la non-préparée domaines. Un rasoir électrique peut se raser de près la fourrure de l'animal. La zone rasée doit être plus grand que le site d'incision.
- L'application ultérieure de crème dépilatoire, comme Nair, va supprimer toutes les fourrures restantes. Appliquer une couche épaisse de crème d'épilation à la zone chirurgicale et laisser agir pendant 3 minutes. Essuyer la fourrure et la crème d'épilation avec une serviette humide. Ne laissez pas la crème épilation au-delà de 10 minutes.
- Utilisez de l'alcool à 70%, ou une solution gommage alternative, pour préparer la zone aseptique chirurgicale.
3. Procédure chirurgicale
- Position de l'animal anesthésié sur une planche inclinée chirurgicale, ou un support de retenue angulaires.
- Faire une petite incision près de la face antérieure du cou (région de la gorge).
- Disséquer loin le peaucier et antérieure muscles trachéaux, afin de visualiser et accéder aux anneaux de la trachée.
- Typiquement, les volumes d'injection intratrachéale de 3 grammes ul par des poids (environ 30 à 75 volumes uL final). Administrer la quantité appropriée de l'aide d'une instillation sous-cutanée de 1 ml (sous-Q) seringue avec un calibre 30, l'aiguille 5/16-inch. Tenez le côté conique de seringues et parallèle à la trachée, et injecter le volume complet de instillation dans la trachée.
- L'animal peut réagir en haletant après l'instillation de soluté dans les poumons. Présentation de l'air à travers la seringue et en observant si les poumons se dilatent confirmera également les techniques de l'intubation.
- Retirez la seringue de la trachée.
4. Sutures.
- Saisir sertissage de l'aiguille (partie la plus épaisse de l'aiguille où le matériel de suture est ci-jointe) avec un porte-aiguille.
- Pénètrent dans la peau avec la pointe de l'aiguille à 90 ° environ 1-3 mm Angle loin du bord de la plaie, en fonction de l'épaisseur de la peau. Saisir l'aiguille de quitter après un passage à travers le tissu. Points de suture simple, nouées individuellement, seront efficacement fermer la plaie.
5. Récupération des animaux
- Les animaux devraient se remettre complètement de l'anesthésie et l'intervention chirurgicale, après 3-24 heures.
6. Les résultats représentatifs
Instillation intratrachéale de composé fluorescent, Cy5.5 conjugué à dextrane, montre l'instillation réussie de composé fluorescent dans B6 poumons de souris (figure 1). Le colorant fluorescent est principalement ciblée sur les poumons et est uniformément répartie. Signal fluorescent dans le tractus gastro-intestinal, immédiatement après la procédure indique que l'œsophage a été intubé par inadvertance lors de la procédure (figure 2). Les enquêteurs peuvent également vérifier la livraison ciblée de composés dans le poumon, et de vérifier la distribution de l'instillation, en suivant la procédure en gonflant les poumons et la préparation des tranches de tissu pulmonaire (2, 3) ou fixes histologique des échantillons.
Figure 1. Fluorescent Cy5.5 signal de co-enregistrées avec des rayons X dans les poumons de souris image de succès inculqué. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (à une concentration de 10 ug / uL) a été instillée dans la trachée des poumons de souris B6. Cy5.5 signal n'a été détecté en utilisant un filtre d'excitation 675 nm et 695 nm d'un filtre d'émission.
Figure 2. Co-enregistrement de signal fluorescent montré avec X-ray superposition de souris mal inculquée. Intubation inapproprié de l'oesophage au cours trachéale des résultats du protocole d'instillation dans Cy5.5 livraison à l'intestin.
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Discussion
Instillations intra-trachéale ont été utilisées dans plusieurs études différentes pour évaluer la toxicité des composés d'essai (6), induisent des lésions pulmonaires alvéolaires (4, 7), remplacer les tensioactifs (8), ainsi que de modifier l'expression des gènes via la livraison de petits oligonucleotides directement dans le poumon (5). Nous explorons actuellement l'utilisation d'instiller 1) fluorescentes redox matériau sensible dans les poumons afin de mesurer le stress oxydatif in vivo dans des conditions normales et physiopathologiques, ainsi que 2) inculquer indicateurs fluorescents avec des composés pharmacologiques, vecteurs d'ADN, les virus et / ou microARN afin d'évaluer l'effet de chaque instillation sur le transport du liquide pulmonaire.
Il ya plusieurs avantages de l'introduction de corps étrangers dans les poumons en utilisant un protocole d'instillation plus l'exposition par inhalation (révisé en (1)). Les principaux avantages de l'utilisation d'un protocole d'instillation comprend limiter l'exposition aux toxiques, des composés cancérigènes ou radioactifs. En outre, les solides ainsi que des matières liquides, peuvent être introduits dans le poumon. Sans doute, le plus grand inconvénient de l'approche utilisant l'instillation trachéale est que l'introduction de l'instillation est invasive et non physiologiques.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH K99 HL09222601 et le S & R Fondation Ryaji Uneo Award décerné à MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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