Summary
Deze video illustreert de techniek voor de extractie van DNA van de soorten van microben woonachtig zijn in de termiet einddarm. De voorbereiding van een natte glijbaan berg, wat handig is voor het visualiseren van de darm microbiële gemeenschap wordt ook geïllustreerd, en een rondleiding door het soortenrijke darm-omgeving wordt gegeven.
Abstract
Termieten zijn een van de weinige dieren waarvan bekend is dat de capaciteit om uitsluitend bestaan door de consumptie van hout hebben. De termiet darm kanaal bevat een dichte en soortenrijk microbiële populatie die bij de afbraak van lignocellulose helpt voornamelijk in acetaat, de belangrijkste voedingsstof brandstof termiet metabolisme (Odelson & Breznak, 1983). Binnen deze microbiële populaties zijn bacteriën, archaea methanogene en, in sommige ("lagere") termieten, eukaryote protozoa. Zo, termieten zijn excellent onderzoek onderwerpen voor het bestuderen van de interacties tussen microbiële species en de vele biochemische functies die ze vervullen in het belang van hun gastheer. De soortensamenstelling van de microbiële populaties in termietenheuvels darmen evenals de belangrijkste genen die betrokken zijn in verschillende biochemische processen is onderzocht met behulp van moleculaire technieken (Kudo et al., 1998;. Schmit-Wagner et al., 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Deze technieken zijn afhankelijk van de extractie en zuivering van hoge kwaliteit nucleïnezuren van de termiet darm-omgeving. De extractie techniek wordt beschreven in deze video is een gewijzigde samenstelling van protocollen ontwikkeld voor de extractie en zuivering van nucleïnezuren van het milieu monsters (Mor et al., 1994;. Berthelet et al., 1996;. Purdy et al., 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al. 2006) en het produceert DNA van termiet einddarm materiaal dat geschikt is voor gebruik als sjabloon voor polymerase chain reaction (PCR).
Protocol
Procedurele samenvatting voor termieten hele darm DNA-extractie:
- Chill termieten op het ijs, te verwijderen darm met behulp van steriele pincet en stabiliseren darm samples in de buffer.
- Homogeniseren monsters in PVPP / SDS / phenol buffer.
- Extract en DNA te zuiveren van ruw lysaat met Qiagen DNeasy kolommen.
Protocol:
- Op ijs, verwijder de ingewanden van de werknemer kaste termieten met behulp van steriele pincet.
- Onmiddellijk overdracht het lef en de inhoud in een steriele, nuclease-vrij buis met 50 ul ijskoude 1x moleculaire biologie kwaliteit TE-buffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze monsters bij -20 ° C, of ga rechtstreeks met de homogenisering.
- Breng de darm monsters en buffer tot een steriele, nuclease-free 2 ml schroef buisje met vooraf geladen met 500 mg steriele zirconia / silica beads (0,1 mm) en 700 pi 1x TE buffer met 1% w / v polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ).
- Voeg 50 ul van 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 500 ul van fenol op de monsters.
- Homogeniseer (kraal beat) op de hoogste stand met behulp van drie cycli van 30 sec homogenisering en 30 sec van koelen op ijs.
- Sediment onoplosbaar materiaal voor een min bij 8000 x g.
- Zuiver 300-ul porties van de waterfase (bovenste) laag met Qiagen DNeasy kolommen volgens de methode beschreven voor het ruwe lysaat zuivering.
- Kwantificeren nucleïnezuur-inhoud en te bevriezen monsters bij -20 ° C voor later gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze ervaring, DNA geëxtraheerd uit de microbiële gemeenschappen van het hout geeft termiet soorten zoals Zootermopis nevadensis is voldoende zuiver voor PCR-sjabloon na een ronde van de extractie en zuivering. Echter, sommige termieten, zoals zwerfvuil-voeding en bodem geeft soorten hebben een hogere concentratie van humuszuren in hun darminhoud en kunnen extra zuivering van darm microbiële DNA nodig hebben. De totale DNA-opbrengst van de ingewanden van 5 Z. nevadensis werknemers is in de range van 10-30 mg. Voor de termiet soorten aanzienlijk kleiner of groter is dan deze soort, kunnen meer of minder exemplaren nodig zijn om een vergelijkbaar bedrag van DNA te verkrijgen.
Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan RNA-extractie mogelijk te maken. Voor RNA-extractie, substituut 1x RNAprotect Bacteriën reagens van Qiagen (catlog geen. 76.506) voor de ijskoude TE-buffer wordt beschreven in stap 2 van het protocol. Qiagen RNeasy reagentia en kolommen (catlog geen. 74.104) moet worden gebruikt in plaats van de DNeasy zuivering hierboven beschreven procedure. Als DNA kan worden gezuiverd uit RNAprotect-gestabiliseerd monsters en slechts 300 pi van de ca.. 700 pi waterlaag opgehaald in stap 7 is vereist voor nucleïnezuur zuivering, deze methode kan worden gebruikt om zowel DNA en RNA te halen in parallel van een enkel monster.
Deze technieken zijn afhankelijk van de extractie en zuivering van hoge kwaliteit nucleïnezuren van de termiet darm-omgeving. De extractie techniek wordt beschreven in deze video is een gewijzigde samenstelling van protocollen ontwikkeld voor de extractie en zuivering van nucleïnezuren van het milieu monsters (Meer et al., 1994;. Berthelet et al., 1996;. Purdy et al., 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al. 2006) en het produceert DNA van termiet einddarm materiaal dat geschikt is voor gebruik als sjabloon voor polymerase chain reaction (PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
