Summary
Nós estabelecemos modelos do rato de leucomalácia periventricular (LPV), a lesão cerebral predominante em prematuros caracterizada por lesões na substância branca periventricular. Hipóxia / isquemia com / sem infecção sistêmica são as principais causas de LPV. Ligadura da carótida unilateral e exposição a hipóxia com / sem injeção de lipopolissacarídeo cria PVL-como lesões em camundongos P6.
Abstract
Nós descrevemos um protocolo para o estabelecimento de modelos de ratos de leucomalácia periventricular (LPV). PVL é a forma predominante de lesão cerebral em bebês prematuros e de o antecedente mais comum de paralisia cerebral. PVL é caracterizada por lesão da substância branca periventricular com lesão oligodendroglial proeminente. Hipóxia / isquemia, com ou sem infecção sistêmica / inflamação são as principais causas de LPV. Nós usamos ratos P6 para criar modelos de lesão cerebral neonatal pela indução de hipóxia / isquemia, com ou sem infecção sistêmica / inflamação com ligadura de carótida unilateral seguido pela exposição à hipóxia, com ou sem injeção de lipopolissacarídeo endotoxina (LPS). Imunohistoquímica da proteína básica da mielina (MBP) ou O1 e exame de microscopia eletrônica mostram perda de mielina proeminente na matéria branca cerebral com dano adicional para o hipocampo eo tálamo. Estabelecimento de modelos do rato do PVL vai facilitar muito o estudo da patogênese da doença usando linhagens de camundongos transgênicos disponíveis, realização de testes de drogas de uma forma relativamente alto rendimento para identificar agentes terapêuticos candidato, e testes do transplante de células-tronco usando linhagens de camundongos imunodeficiência.
Protocol
Procedimentos detalhados de criação de lesão cerebral neonatal em ratos P6:
- Pós-natal do dia 6 (P6) ratos são anestesiados com refrigeração indireta sobre o gelo ao ponto de insensibilidade ao estímulo nocivo (anestesia profunda).
- Após a limpeza da pele com álcool, uma incisão mediana ventral é feita no pescoço anterior.
- Sob um microscópio de dissecação, a bifurcação da artéria carótida comum direita é abordado por gentilmente retrair os músculos omo-hióideo e esternocleidomastóideo.
- A fascia em torno da bainha carotídea é removido, eo ramo proximal interna isolada do nervo vago nas proximidades e gânglios simpáticos com um gancho. A artéria carótida interna é então cauterizados com uma ponta de cauterização.
- Após a cauterização, a incisão na pele é suturada, eo animal é mantido quente até que esteja completamente desperto e depois voltou para a represa.
- Uma hora após a ligadura, o animal é colocado em uma câmara selada infundido com nitrogênio, até um nível de 6,0% O 2 é atingido. O animal é então exposto a 35 min de hipóxia.
- Após a exposição a hipóxia, o mouse se recupera em uma almofada de aquecimento (33 ° C) por 30 min e depois é devolvido à represa. Para a criação de lesão cerebral com hipóxia combinado / isquemia e infecção / inflamação, o animal é então injetado intraperitonealmente com 0,015 ml de lipopolissacarídeo (LPS, 1 mg / kg).
- Quatro dias post-hypoxia/ischemia, os ratos são anestesiados com refrigeração indireta sobre o gelo até o ponto de indiferença a estímulos nocivos, então perfundidos com solução salina e, em seguida, paraformaldeído 4%. Cérebros são removidos e cryoprotected.
Figura 1. Caracterização de lesão cerebral no modelo do rato hipóxica / isquêmica com coloração H & E. Há necrose focal (setas) na substância branca cerebral ipsilateral (A) para a ligadura de carótida, em comparação com a matéria cerebral contralateral branco (B). Necrose focal ipsilateral e microinfartos são observadas no hipocampo (C) eo tálamo (D) no cérebro com lesão da substância branca cerebral ipsilateral.
Resultados representante e números:
Modelos do rato do PVL com hipóxia / isquemia e / ou infecção / inflamação são alcançados pela ligadura de carótida unilateral seguido pela exposição à hipóxia e injeção de LPS. Estamos definindo os modelos novo mouse como adequados modelos LPV. O estudo neuropatológico de cortes coronais corados com hematoxilina e eosina (H & E) através da parte frontal do cérebro inteiro revela necrose focal na questão central branca do hemisfério cerebral ipsilateral à ligadura de carótida (Fig. 1A), com relativa preservação dos neurônios no o córtex cerebral sobrejacente comparação com a matéria cerebral contralateral branco (Figura 1B). Em matéria de necrose focal branco, existe um marcado aumento da celularidade composto de macrófagos e astrócitos reativos, como é característico de LPV focal humana. Na questão central contralateral branca, os núcleos são organizados em oligodendroglial fascicular-como feixes, essa arquitetura é completamente interrompido pela necrose focal no lado ipsilateral. De nota, também observamos necrose ipsilateral no hipocampo (Fig. 1C) eo tálamo (microinfartos focal) (Figura 1D) no cérebro com lesão da substância branca cerebral ipsilateral. PVL humana também não ocorre em completo isolamento que acompanham lesões massa cinzenta. A marca da PVL é o relativo, embora não seja completa, poupando do córtex cerebral que cobre o assunto feridos branco - um recurso que nós acreditamos que está presente em nossos modelos de mouse.
Figura 2. Escala de pontuação de 0-5 para avaliar lesão da substância branca pelo PAM ou O1 em modelos do rato de leucomalácia periventricular.
Nossos modelos de rato mostram características de PVL, tanto a nível fenotípico e molecular. Temos usado a detecção imunocitoquímica da proteína básica da mielina (MBP) ou O1 antígeno para avaliar lesão, criaram uma escala padrão 0-5 para marcar a lesão da substância branca (Fig. 2), e caracterizaram a substância branca patologia (Fig . 3). Mais recentemente, um ensaio não-tendenciosa estereológica foi implementado para substituir o método semi-quantitativo inicial. Além disso, para testar efeitos correlatos de lesão da substância branca nos resultados funcionais, temos realizado testes comportamentais para a função motora. Temos demonstrado que os ratos apresentam déficits motores atacando P10-21 hipóxia seguintes / isquemia mais LPS em P6. Nós estabelecemos critérios de pontuação com uma escala de 0-4 para definir disfunção membro contralateral em ratos feridos no P10-21. Normalmente, os ratos normais pode scamper uma inclinação de 30 º (nota 4) e subir a 45 ° inclinação sem deslizar (escore de 3). Camundongos feridos têm notas mais baixas em correlação com os graus de lesão da substância branca.
Figura 3. Caracterização de lesão da substância branca pelo PAM ou O1 coloração e estrutura da mielina por microscopia eletrônica (EM). MBP e coloração O1 mostrar a perda de mielina na substância branca cerebral ipsilateral à ligadura, em comparação com substância branca contralateral. EM exame mostra axônios mielinizados na massa branca cerebral contralateral à ligadura e degenerou tecido na substância branca ipsilateral.
Prevemos que o estabelecimento dos modelos novo mouse da LPV nos permitirá estudar mecanismos específicos de PVL-like lesão no cérebro imaturo. Iremos abordar patogênese usando linhagens de camundongos transgênicos para examinar o papel de moléculas individuais de interesse e avaliar as metas de neuroproteção.
Discussion
Prejuízo para o desenvolvimento do cérebro leva a consequências devastadoras neurológicos. Surpreendentemente, o padrão de lesão cerebral perinatal é altamente dependente da idade. Em bebês nascidos a termo, que afeta predominantemente o córtex cerebral com perda neuronal característica. No entanto, em bebês prematuros, que afeta seletivamente substância branca cerebral com lesão importante para o desenvolvimento oligodendrócitos, um distúrbio chamado de leucomalácia periventricular (LPV). A magnitude do problema de lesão cerebral em bebês prematuros é extraordinário. Parto prematuro e de cuidados intensivos neonatal melhorou levaram a quase 90% de sobrevivência dos 13 milhões de bebês prematuros em todo o mundo (cerca de 56.000 nos Estados Unidos), nascido anual com um peso menor que 1500 gramas, ou seja, de muito baixo peso ao nascer. Aproximadamente 10% dos sobreviventes posteriormente apresentam paralisia cerebral e cerca de 50% têm déficit cognitivo e comportamental. PVL é o mais importante patologia cerebral paralisia cerebral subjacente em prematuros. Nenhuma terapia específica para PVL existe presentemente, em parte porque a patogênese não foi bem compreendida 1,2.
Embora a etiologia da PVL é multifatorial, perinatal hipóxia / isquemia com infecção intra-uterina materna é pensado para ser uma causa primária de LPV. Um modelo de hipóxia / isquemia da LPV no rato em P7 foi previamente estabelecido 3. Este modelo é o único que se assemelha a PVL em prematuros. A principal característica deste modelo é seletiva substância branca patologia, em contraste com a maioria dos modelos de acidente vascular cerebral que são caracterizados por infarto massa cinzenta. No entanto, as limitações do modelo hipóxico-isquêmica no rato não deve ser menosprezada. Primeiro, a etiologia da PVL é frequentemente multifatorial. Além da inflamação hipóxia / isquemia, infecção materno-fetal / está fortemente associada a LPV. Assim, a inflamação hipóxia / isquemia e infecção / combinado provavelmente criar modelos mais PVL-like. A idade de roedores que melhor se correlaciona com o período de desenvolvimento humano de maior risco para lesões PVL (24-32 semanas de gestação) é pós-natal, porque a diferenciação oligodendroglial é predominantemente um evento pós-natal em roedores. Como é impossível produzir uma infecção materno-fetal / inflamação nas idades pós-natal, seria razoável para simular uma infecção numa fase pós-natal relevantes do desenvolvimento para criar um modelo do roedor da LPV. Temos procurado combinar a injeção de LPS com o modelo hipóxica / isquêmica em ratos em P6, para produzir mais clinicamente relevantes lesões LPV. Em segundo lugar, a abordagem de prova de conceito do ideal experimental para um papel causal de uma molécula requer o uso de camundongos transgênicos; manipulações genéticas são muito mais difíceis no rato do que no mouse. Assim, procuramos converter o nosso modelo experimental de PVL do rato para o mouse.
Modelos do rato do PVL irá facilitar grandemente 1) o estudo da biologia da doença e patogênese disponíveis usando linhagens de camundongos transgênicos, 2) realização de testes de drogas para descobrir agentes candidato com potencial terapêutico; 3) testar a utilidade de células-tronco usando linhagens de camundongos imunodeficientes.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é, em parte suportado por concessões do National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Multiple Sclerosis Society Nacional, Fundação Roche para Anemia Research, Feldstein Fundação Médica e Hospitais Shriners para Crianças.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Prazer para suas sugestões. Este trabalho foi em parte suportado por concessões para WD de National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Sociedade Nacional de Esclerose Múltipla, e Hospitais Shriners para Crianças. Declaramos a inexistência de interesses concorrentes relacionados para este artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
