Summary
أنشأنا نماذج من الماوس تلين بيضاء المحيط بالبطينات (PVL) ، وإصابات الدماغ السائد في الخدج تتميز الآفات حول البطينات الدماغية المادة البيضاء. نقص الأكسجة / نقص التروية مع / بدون العدوى الجهازية هي الأسباب الرئيسية للPVL. ربط الشريان السباتي والتعرض من جانب واحد مع نقص الأكسجة / بدون حقن lipopolysaccharide PVL يخلق مثل الآفات في الفئران P6.
Abstract
وصفنا بروتوكولا لإنشاء نماذج من الماوس تلين بيضاء المحيط بالبطينات (PVL). PVL هو الشكل السائد للإصابات الدماغ في الأطفال الخدج وسابقة الأكثر شيوعا من الشلل الدماغي. يتميز PVL التي تلف المادة البيضاء حول البطينات الدماغية بسبب الاصابة oligodendroglial بارزة. نقص الأكسجة / نقص التروية مع أو بدون إصابة جهازية / التهاب هي الأسباب الرئيسية للPVL. نستخدم الفئران P6 لخلق نماذج من إصابات الدماغ قبل الولادة تحريض نقص الأكسجة / نقص التروية مع أو بدون إصابة جهازية / التهاب الشريان السباتي من جانب واحد مع ربط تليها التعرض لنقص الأكسجين مع أو بدون حقن الذيفان الداخلي lipopolysaccharide (LPS). المناعية للبروتين النخاعين الأساسي (MBP) أو O1 والفحص المجهري الإلكترون تظهر بارزة فقدان النخاعين في المادة البيضاء مع الضرر الدماغي إضافية إلى الحصين والمهاد. وإنشاء نماذج الماوس من PVL يسهل إلى حد كبير في دراسة المرضية المرض باستخدام الماوس المتاحة سلالات معدلة وراثيا ، التوصيل من المحاكمات المخدرات بطريقة إنتاجية عالية نسبيا لتحديد مرشح وكلاء العلاجية ، واختبار زرع الخلايا الجذعية باستخدام سلالات الفأر نقص المناعة المكتسب.
Protocol
إجراءات تفصيلية لخلق الولدان إصابات الدماغ لدى الفئران P6 :
- بعدها يوم 6 (P6) الفئران هي تخدير مع التبريد غير المباشرة على الجليد إلى نقطة عدم استجابتها لتحفيز الضارة (تخدير عميق).
- بعد تنظيف البشرة مع الكحول ، ويتم إجراء شق بطني خط الوسط في الرقبة الأمامية.
- تشريح تحت المجهر ، واقترب من التشعب من الشريان السباتي الأيمن المشتركة من خلال التراجع برفق عضلات اللامية الكتفية والقصية الترقوية الخشائية.
- تتم إزالة اللفافة حول غمد السباتي ، وفرع القريبة الداخلية المعزولة من العصب المبهم القريبة والعقد متعاطفة مع هوك. ومن ثم أكتوي الشريان السباتي الداخلي باستخدام تلميح الكي.
- التالية الكي ، هو خياطة شق الجلد ، ويتم الاحتفاظ الحيوان دافئ حتى مستيقظا تماما ، ثم عاد الى السد.
- ساعة واحدة بعد ربط ، يتم وضع الحيوانات في غرفة مغلقة مع النيتروجين غرست حتى مستوى 6.0 ٪ الذي تم التوصل إليه هو O 2. ثم يتعرض هذا الحيوان إلى 35 دقيقة من نقص الأكسجين.
- بعد التعرض نقص الأكسجين ، ويسترد الماوس على وسادة التدفئة (33 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة ثم يتم إرجاعها إلى السد. لإنشاء إصابات الدماغ بنقص الأكسجة مجتمعة / نقص التروية والعدوى / التهاب ، ثم يتم حقن الحيوان intraperitoneally مع 0.015 مل من lipopolysaccharide (LPS ، 1 ملغ / كلغ).
- post-hypoxia/ischemia أربعة أيام ، يتم تخدير الفئران مع التبريد غير المباشرة على الجليد إلى نقطة عدم استجابتها للمؤثرات الضارة ، ثم مع perfused المالحة ثم بارافورمالدهيد 4 ٪. تتم إزالة العقول وcryoprotected.
الشكل 1. توصيف إصابات الدماغ في نموذج الفأر ميتة / الدماغية مع H & E تلطيخ. هناك تنسيق نخر (الأسهم) في المسألة الأبيض المماثل الدماغي (أ) إلى ربط الشريان السباتي ، مقارنة مع المسألة المقابل بيضاء الدماغي (B). لوحظ نخر المماثل microinfarcts والتنسيق في قرن آمون (C) ، والمهاد (D) في أدمغة مع المماثل الدماغي إصابة المادة البيضاء.
النتائج تمثيلا وارقام :
وتتحقق من نماذج الماوس PVL مع نقص الأكسجة / نقص التروية و / أو العدوى / التهاب الشريان السباتي عن طريق ربط طرف واحد يليه التعرض لنقص الأكسجين ، وحقن LPS. نحن تحديد نماذج الماوس الجديد كنماذج PVL مناسبة. فحص Neuropathological أقسام الاكليلية ملطخة الهيماتوكسيلين - يوزين و(H & E) عن طريق الدماغ المقدم برمته يكشف تنخر في المسألة الأبيض المركزية في نصف الكرة المخية المماثل لربط الشريان السباتي (الشكل 1A) ، مع تجنيب النسبية للخلايا العصبية في القشرة الدماغية مقارنة المغطي لهذه المسألة المقابل بيضاء الدماغي (1B الشكل). في هذه المسألة المحورية الأبيض نخرية ، هناك زيادة ملحوظة في الخلوية الضامة والتي تتكون من الخلايا النجمية على رد الفعل ، كما هو من سمات الإنسان PVL التنسيق. في المقابل بيضاء المسألة المركزية ، ويتم ترتيب نوى oligodendroglial في حزمي مثل حزم ؛ تتعطل تماما هذه العمارة التي تنخر في الجانب المماثل. من المذكرة ، نلاحظ أيضا نخر المماثل في الحصين (الشكل 1C) والمهاد (microinfarcts الاتصال) (الشكل 1D) في أدمغة مع المماثل الدماغي إصابة المادة البيضاء. PVL الإنسان أيضا لا يحدث في عزلة تامة عن الآفات المصاحبة المادة الرمادية. السمة المميزة لPVL هو نسبي ، وإن لم تكن كاملة ، وتجنيب لقشرة الدماغ التي تغمر المسألة جرح البيضاء -- وهي الميزة التي نعتقد أنها موجودة في النماذج الماوس لدينا.
الشكل 2. مقياس من 0-5 سجل لتقييم الضرر الأبيض المسألة MBP O1 أو في نماذج من الماوس تلين بيضاء المحيطة بالبطين.
لدينا نماذج الماوس تظهر خصائص PVL على الصعيدين المظهري والجزيئي. وقد استخدمنا الكشف immunocytochemical للبروتين النخاعين الأساسي (MBP) أو O1 مستضد لتقييم الضرر ، ووضع جدول القياسية 0-5 ليسجل اصابة في المادة البيضاء (الشكل 2) ، واتسمت الأبيض الباثولوجيا المسألة (الشكل 3). في الآونة الأخيرة ، وقد تم تنفيذ مقايسة غير المنحازة stereological أن تكون بديلا عن الأسلوب شبه الكمية الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، لاختبار آثار متلازم معها للإصابة المادة البيضاء على النتائج الفنية ، وقد أجرينا الاختبارات السلوكية لوظيفة الحركية. لقد أثبتنا أن الفئران يحمل العجز الحركي ضرب نقص الأكسجة التالية P10 - 21 / بالاضافة الى نقص التروية LPS في P6. أنشأنا معايير التهديف مع مقياس من 0-4 لتحديد الطرف المقابل اختلال وظيفي في الفئران الجرحى في P10-21. عادة ، يمكن أن الفئران العادية عدو بإعداد 30 درجة المنحدر (درجة 4) ويصعد بإعداد 45 درجة انحدر دون انزلاق (درجة 3). الفئران قد أصيب العشرات في أدنى علاقة مع درجة الضرر المادة البيضاء.
الشكل 3. توصيف إصابة المادة البيضاء التي MBP O1 أو تلطيخ وهيكل الميلين بواسطة المجهر الالكتروني (EM). MBP وتلطيخ O1 فقدان الميلين تظهر في المادة البيضاء في الدماغ المماثل الربط ، بالمقارنة مع المادة البيضاء المقابل. EM يظهر الفحص العصبي المحاوير في المادة البيضاء في الدماغ المقابل ربط وتدهورت في أنسجة المادة البيضاء المماثل.
ونحن نتوقع أن إنشاء نماذج جديدة من الماوس PVL سيسمح لنا لدراسة آليات محددة لPVL مثل إصابة في الدماغ غير ناضجة. وسوف نتناول المرضية باستخدام سلالات الماوس المعدلة وراثيا لدراسة دور الجزيئات الفردية للاهتمام وتقييم أهداف العصبية.
Discussion
إصابة في الدماغ النامية يؤدي إلى عواقب والعصبية المدمرة. لافت للنظر ، ونمط إصابات الدماغ قبل الولادة هو غاية سن المعتمدة. في الرضع الأجل ، فإنه يؤثر بالدرجة الأولى قشرة الدماغ العصبية مع فقدان مميزة. ووصف اضطراب ولكن في الأطفال الخدج ، فإنه يؤثر بشكل انتقائي مع المادة البيضاء الدماغية إصابة بارزة لoligodendrocytes النامية ، تلين بيضاء المحيط بالبطينات (PVL). حجم مشكلة إصابات الدماغ في السابق لأوانه الرضع غير عادي. وقد أدت الولادة المبكرة وتحسين الرعاية المركزة لحديثي الولادة الى ما يقرب من 90 ٪ من بقاء الرضع 13000000 سابق لأوانه في جميع أنحاء العالم (حوالي 56000 في الولايات المتحدة) سنويا ولدوا مع الوزن عند الولادة اقل من 1500 غراما ، أي منخفضة جدا الوزن عند الولادة الرضع. حوالي 10 ٪ من الناجين من المعرض في وقت لاحق الشلل الدماغي وحوالي 50 ٪ من العجز المعرفي والسلوكي. PVL هو أهم أمراض الدماغ الكامنة وراء الشلل الدماغي في الأطفال الخدج. لا يوجد علاج محدد لPVL موجود في الوقت الحاضر ، في جزء منه لأن المرضية لم تكن مفهومة جيدا 1،2.
على الرغم من أن مسببات PVL غير سياقاتها ، ويعتقد أن فترة ما حول الولادة نقص الأكسجة / نقص التروية العدوى داخل الرحم مع الأمهات أن يكون السبب الرئيسي للPVL. وثمة نموذج ميتة / الدماغية من PVL في الفئران في P7 أنشئت سابقا 3. هذا نموذج فريد من نوعه من حيث أنه يشبه PVL في الأطفال الخدج. السمة المميزة لهذا النموذج هو انتقائي الأبيض الباثولوجيا المسألة ، على النقيض من غالبية نماذج السكتة الدماغية التي تتميز احتشاء المادة الرمادية. ومع ذلك ، لا ينبغي أن القيود المفروضة على نموذج ميتة ، نقص تروية في الفئران يمكن تجاهلها. الأولى ، هي مسببات PVL سياقاتها في كثير من الأحيان. بالإضافة إلى التهاب نقص الأكسجة / نقص التروية ، إصابة الأم والجنين / ويرتبط بقوة مع PVL. وبالتالي ، فإن الجمع بين التهاب نقص الأكسجة / نقص التروية والعدوى / إنشاء نماذج أكثر احتمالا PVL الشبيهة. عمر القوارض التي يرتبط أفضل فترة من التنمية البشرية لأشد المخاطر للآفات PVL (24-32 أسبوعا من الحمل) هو ما بعد الولادة لأن التمايز oligodendroglial هي في الغالب بعد الولادة حدثا في القوارض. كما أنه من المستحيل أن تنتج العدوى الأم والجنين / التهاب في العصور التالية للولادة ، فإنه يكون من المعقول لمحاكاة العدوى في مرحلة ما بعد الولادة التنموية ذات الصلة لخلق نموذج من القوارض PVL. وقد سعينا للجمع بين LPS الحقن مع نموذج ميتة / الدماغية لدى الفئران في P6 ، لإنتاج مزيد من الآفات PVL سريريا ذات الصلة. الثانية ، والأمثل لإثبات أنها مفهوم المنهج التجريبي لدور المسبب للمرض من جزيء يتطلب استخدام الفئران المعدلة وراثيا ؛ التلاعب الجيني هي أصعب بكثير في الجرذان مما كان عليه في الماوس. وبالتالي ، فقد سعينا لتحويل نموذجنا التجريبي لPVL من الفئران على الماوس.
نماذج من الماوس وسوف يسهل كثيرا PVL 1) دراسة بيولوجيا المرض والمرضية باستخدام الماوس المتاحة سلالات محورة جينيا ، 2) التوصيل من التجارب لاكتشاف المخدرات وكلاء المرشحين المحتملين مع العلاجية ؛ 3) اختبار مدى فائدة الخلايا الجذعية باستخدام سلالات الفأر العوز المناعي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل هو في جزء منه بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (وRO1 NS059043 ES015988 RO1) ، جمعية التصلب المتعدد الوطنية ، شركة روش مؤسسة البحوث فقر الدم ، فيلدشتاين المؤسسة الطبية ، وShriners مستشفيات للأطفال.
نود أن نشكر الدكتور ديفيد متعة على اقتراحاته. وكان في جزء منه دعم هذا العمل عن طريق منح لWD من المعاهد الوطنية للصحة (وRO1 NS059043 ES015988 RO1) ، الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد ، وShriners مستشفيات للأطفال. لم نعلن المصالح المتنافسة المتعلقة بهذه المادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
