Summary
我々は、脳室周囲白質軟化症（PVL）、脳室周囲白質病変を特徴と未熟児で優勢な脳損傷のマウスモデルを確立した。全身感染症有/無低酸素/虚血は、PVLの主な原因です。リポ多糖注入なし/付き片側頸動脈結紮及び低酸素曝露がP6マウスのPVL様病変を作成します。
Abstract
我々は、脳室周囲白質軟化症（PVL）のマウスモデルを確立するためのプロトコルについて説明します。 PVLは早産児と脳性麻痺の最も一般的な先行詞の脳損傷の主要な形態である。 PVLは、著名なオリゴデンドログリア損傷と脳室周囲白質の損傷によって特徴づけられる。全身感染症/炎症の有無にかかわらず、低酸素/虚血は、PVLの主な原因です。我々は、エンドトキシンのリポ多糖の注入の有無にかかわらず、低酸素への曝露（LPS）に続く片側頸動脈結紮による全身感染症/炎症の有無にかかわらず、低酸素/虚血の誘導により、新生児の脳損傷のモデルを作成するためにP6マウスを使用してください。ミエリン塩基性タンパク質（MBP）またはO1および電子顕微鏡検査の免疫組織化学では、海馬と視床への追加ダメージと大脳白質の顕著なミエリンの喪失を示しています。 PVLのマウスモデルの確立は、大幅に利用可能なトランスジェニックマウス系統を用いて疾患の病因の研究、候補治療薬を、および免疫不全マウス系統を用いた幹細胞移植のテストを識別するために、相対的に高いスループットの方法で薬剤の臨床試験の伝導を容易にするでしょう。
Protocol
P6マウスの新生児の脳損傷の作成の詳細な手順：
- 生後6日目（P6）のマウスは、有害な刺激への無反応のポイント（深麻酔）に氷の上で間接冷却で麻酔する。
- アルコールで皮膚を洗浄に続いて、正中腹側切開は、前頸部で作られています。
- 解剖顕微鏡下で、右総頸動脈の分岐部を静かに後退肩甲舌骨と胸鎖乳突筋の筋肉をが近づいています。
- 頸動脈鞘の周囲筋膜が除去され、近位内部の分岐は、フックに近い迷走神経および交感神経節から分離されています。内頸動脈は、焼灼先端を使用して焼灼しています。
- 焼灼に続いて、皮膚の切開を縫合され、そして動物は完全に目覚めまで保温し、ダムに戻されます。
- 一時間結紮した後、動物は、O 2に到達すると6.0％のレベルまで窒素を流し込んで密封されたチャンバ内に配置されます。動物は、その後、低酸素症の35分に公開されます。
- 低酸素暴露後、マウスは30分間加熱パッド（33℃）に回復し、ダムに戻されます。を組み合わせた低酸素/虚血や感染/炎症と脳損傷の作成のために、動物は、リポ多糖の0.015ミリリットル（LPS、1 mg / kg）の腹腔内に注入されます。
- post-hypoxia/ischemia 4日間、マウスはその後、その後、生理食塩水と4％パラホルムアルデヒドで灌流侵害刺激への無応答のポイントまで氷上で間接冷却で麻酔する。脳を除去し、凍結保護されています。
図1 H＆E染色による虚血/低酸素マウスモデルにおける脳損傷の特性評価。同側の大脳白質に巣状壊死（矢印）（）対側大脳白質（B）に比べて、頸動脈結紮することがあります。同側の壊死と焦点microinfarctsは海馬（C）と同側の大脳白質損傷の脳の視床（D）で観察されています。
代表的な結果と図：
低酸素/虚血および/または感染/炎症とPVLのマウスモデルは、低酸素とLPSの注射への曝露が続く片側頸動脈結紮することにより達成されています。我々は適切なPVLモデルとして新しいマウスモデルを定義している。全体の前脳を通してヘマトキシリンとエオジン（H＆E）で染色された冠状切片の神経病理学的検査では、ニューロンの相対的な温存と、頸動脈結紮（ 図1A）に同側の大脳半球の中央の白質に巣状壊死が明らかに覆う大脳皮質は、対側大脳白質（ 図1B）に比べて。焦点人間のPVLの特徴であるとして焦点壊死性白質で、マクロファージと反応性星状細胞で構成される細胞数の顕著な増加は、そこです。反対側の中央の白質では、オリゴデンドログリアの核は束のような束に配置され、このアーキテクチャは、完全に同側で巣状壊死が中断されます。注目すべきは、我々はまた、同側の大脳白質損傷のある脳で同側の海馬の壊死（ 図1C）と視床（フォーカルmicroinfarcts）（ 図1D）を観察します。人間のPVLはまた灰白質の病変を伴うから、完全な分離では発生しません。我々はマウスモデルに存在すると信じている機能 - PVLの特徴は、負傷した白質を覆う大脳皮質の温存、完全ではないが、相対的なものです。
図2脳室周囲白質軟化症のマウスモデルでMBPまたはO1による白質傷害を評価するための0-5のスコアリングスケール。
私たちのマウスモデルは、表現型と分子レベルの両方でPVLの特性を示します。我々は、傷害を評価するためにミエリン塩基性タンパク質（MBP）またはO1 -抗原の免疫細胞化学的検出を使用している白質の損傷を（ 図2）スコアを0から5の標準的な規模を確立している、と白質病変（ 図を特徴づけている3）。最近では、非バイアスされた立体的アッセイは、初期の半定量的方法の代わりに実装されています。さらに、機能的転帰の白質損傷の相関の効果をテストするために、我々は、運動機能のための行動テストを実施している。我々は、マウスがP6でP10 - 21以下の低酸素/虚血に加えてLPSで印象的な運動障害を示すことを明らかにした。我々はP10で負傷したマウスでは対側肢の機能障害を定義するために0〜4の尺度で得点基準を確立している-21。通常は、正常なマウスは°傾斜（4のスコアを）30まで走ると滑りなしの45 °傾斜（3のスコアを）登ることができます。負傷したマウスは、白質傷害の程度と相関の低いスコアを持っている。
図3。MBPまたは電子顕微鏡（EM）によるO1染色し、ミエリン構造による白質傷害のキャラクタリゼーション。 MBPと反対側の白質と比較してライゲーションに同側の大脳白質におけるO1の染色ショーミエリンの喪失、。 EMは、検査は、ライゲーションに対側大脳白質の有髄軸索を示し、同側の白質の組織を変性。
我々は、PVLの新しいマウスモデルの確立は、私たちは未熟な脳にPVLのような傷害の特定のメカニズムを研究できるようになると期待しています。我々は興味の個々の分子の役割を検討し、神経保護の目標を評価するトランスジェニックマウス系統を用いて病因に対処します。
Discussion
発展途上の脳への損傷は、壊滅的な神経学的な結果につながります。驚くべきことに、周産期の脳損傷のパターンは非常に年齢依存性である。正期産児では、それは主に特徴的な神経細胞の損失と大脳皮質に影響を与えます。しかし、未熟児で、それが選択的に開発するオリゴデンドロサイトへの顕著な損傷と大脳白質に影響を与える、障害は脳室周囲白質軟化症（PVL）と呼ばれる。未熟児の脳損傷の問題の大きさは尋常ではない。早産と改善された新生児集中治療室は、1500グラムの下で出生時体重で毎年生まれた世界的な1300万未熟児（約56000米国では）、すなわち、非常に低出生体重児の生存率の90％近くにつながっている。生存者の約10％はその後、脳性麻痺を示し、約50％は認知行動障害を持っている。 PVLは、未熟児で最も重要な脳の病理学、基礎となる脳性麻痺です。病因はよく1,2を理解されていないため、PVLのための特定の治療法は、現在一部で、存在しない。
PVLの病因は多因子的であるが、母親の子宮内感染と周産期低酸素/虚血は、PVLの主な原因と考えられている。 P7でのラットにおけるPVLの低酸素/虚血モデルは、以前は次の3確立されている。このモデルは、未熟児におけるPVL似ている点でユニークです。このモデルの特徴は、灰白質の梗塞によって特徴付けられるストロークモデルの大部分とは対照的に、選択的な白質病変です。しかし、ラットにおける低酸素性虚血モデルの限界を見落としてはならない。最初に、PVLの病因はしばしば多因子です。低酸素/虚血、母体胎児感染/炎症に加えて強くPVLに関連付けられています。従って、複合低酸素/虚血や感染/炎症は、おそらくより多くのPVL -のようなモデルを作成します。オリゴデンドログリアの分化は、主にげっ歯類における出生後のイベントなのでベストはPVL病変（妊娠の24〜32週）の最大のリスクの人間の発育期間と相関する齧歯類の年齢は生後です。それは出生後年齢の母体胎児感染/炎症を生成することは不可能であるとして、それはPVLの齧歯類モデルを作成するために、関連する生後発達の段階で感染をシミュレートするために合理的であろう。我々は、より臨床的に関連PVL病変を生成するために、P6でのマウスの低酸素/虚血モデルとLPSの注射を組み合わせることが求められている。第二に、分子の原因となる役割のための最適の概念実証実験的なアプローチは、トランスジェニックマウスの使用を必要とする、遺伝子操作はマウスよりもラットではるかに困難です。従って、我々は、ラットからマウスにPVLの我々の実験モデルを変換しようとしてきた。
PVLのマウスモデルは、大きく1）疾患の生物学および病因の研究が可能なトランスジェニックマウス系統を用いて容易にする、2）薬剤の臨床試験の伝導を治療法としての可能性に候補薬剤を発見するために、免疫不全マウス系統を用いて幹細胞の有用性3）テスト。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（RO1 NS059043とRO1 ES015988）、全国多発性硬化症協会、貧血の研究、フェルドスタイン医学財団のためのロシュ財団、とシュライナーズ子ども病院からの補助金によってサポートされている部分になります。
我々は彼の提案のためにデビッドの喜びを感謝したいと思います。この作品は、部分的に国立衛生研究所からWDへの補助金（RO1 NS059043とRO1 ES015988）、国立多発性硬化症協会、とシュライナーズ子ども病院によってサポートされていました。我々はこの記事に関連する一切の競合する利害を宣言しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
