Summary
Vi etablerade musmodeller av periventrikulär leukomalacia (PVL), det dominerande hjärnskada hos prematura barn kännetecknas av periventrikulär vita substansen lesioner. Hypoxi / ischemi med / utan systemisk infektion är de främsta orsakerna till PVL. Ensidig halspulsådern ligatur och hypoxi exponering med / utan lipopolysackarid injektion skapar PVL-liknande lesioner i P6 möss.
Abstract
Vi beskriver ett protokoll för upprättandet musmodeller av periventrikulär leukomalacia (PVL). PVL är den dominerande formen av hjärnskada hos prematura barn och de vanligaste föregångare av cerebral pares. PVL kännetecknas av periventrikulär vita substansen skadas med framträdande oligodendroglial skada. Hypoxi / ischemi med eller utan systemisk infektion / inflammation är de främsta orsakerna till PVL. Vi använder P6 möss att skapa modeller av neonatal hjärnskada genom induktion av hypoxi / ischemi med eller utan systemisk infektion / inflammation med unilateral halspulsådern ligation följt av exponering för hypoxi, med eller utan injektion av endotoxin lipopolysackarid (LPS). Immunohistokemi av myelin grundläggande protein (MBP) eller O1 och elektron mikroskopisk undersökning visar framstående myelin förlust i cerebrala vit substans med ytterligare skador på hippocampus och thalamus. Inrättande av musmodeller av PVL kommer att kraftigt underlätta studier av sjukdomen patogenes använda tillgängliga transgen mus stammar, överledning av läkemedelsprövningar i en relativt hög genomströmning sätt att identifiera kandidat terapeutiska medel, och testning av stamcellstransplantation med immunbrist musstammar.
Protocol
Detaljerade förfaranden för att skapa neonatal hjärnskada i P6 möss:
- Postnatal dag 6 (P6) möss bedövas med indirekt kylning på is till den grad att inga reaktioner på skadliga stimulering (djup narkos).
- Efter rengöring av huden med alkohol, är ett mittlinjen ventrala snitt i främre halsen.
- Enligt en dissekera mikroskop, är bifurkation av rätten gemensamma halspulsådern närmade sig genom att försiktigt dra tillbaka omohyoid och sternocleidomastoideus musklerna.
- Fascian runt halspulsådern slida tas bort och den proximala interna gren isolerade från den närliggande vagusnerven och sympatiska ganglier med en krok. Den interna halspulsådern är då flamberats med en etsande spets.
- Efter kauterisation, huden är snittet sys, och djuret hålls varm tills helt vaken och återvände sedan till dammen.
- En timme efter ligation är djuret placeras i en sluten kammare infunderas med kväve tills en nivå på 6,0% O 2 nås. Djuret är då utsätts för 35 min av hypoxi.
- Efter hypoxi exponering, återhämtar musen på en värmedyna (33 ° C) i 30 min och sedan tillbaka till dammen. För skapandet av hjärnskada med kombinerad hypoxi / ischemi och infektion / inflammation, är djuret sedan injiceras intraperitonealt med 0,015 ml lipopolysackarid (LPS, 1 mg / kg).
- Fyra dagar post-hypoxia/ischemia, möss bedövas med indirekt kylning på is till den grad att inga reaktioner på skadliga stimuli, sedan perfusion med saltlösning och därefter 4% paraformaldehyd. Hjärnor är bort och cryoprotected.
Figur 1. Karakterisering av hjärnskada i hypoxiska / ischemisk musmodell med H & E färgning. Det finns fokal nekros (pilar) i hjärnans vita substans ipsilaterala (A) till halspulsådern ligering, jämfört med det kontralaterala cerebral vita substansen (B). Ipsilaterala nekros och fokus microinfarcts observeras i hippocampus (C) och Thalamus (D) i hjärnan med ipsilaterala cerebral vita substansen skada.
Representativa resultat och siffror:
Musmodeller av PVL med hypoxi / ischemi och / eller infektion / inflammation uppnås genom ensidiga halspulsådern ligation följt av exponering för hypoxi och injektion av LPS. Vi definierar den nya musmodeller som lämpliga PVL modeller. Neuropatologiska undersökning av koronalt sektioner färgades med hematoxylin-och eosin (H & E) genom hela framhjärnan avslöjar fokal nekros i centrala vita substansen i hjärnhalva ipsilaterala till halspulsådern ligation (Fig. 1A), med relativt sparsamt av nervceller i den överliggande hjärnbarken jämfört med kontralaterala cerebral vita substansen (Fig. 1B). I fokus nekrotiska vita substansen, är det markant ökning cellularitet bestående av makrofager och reaktiva astrocyter, som är karakteristisk för centrala mänskliga PVL. I den kontralaterala centrala vita substansen är de oligodendroglial kärnor arrangeras i fascicular-liknande paket, denna arkitektur är helt störd av fokal nekros på ipsilaterala sidan. Notera observerar vi också ipsilateralt nekros i hippocampus (bild 1C) och Thalamus (fokala microinfarcts) (Fig. 1D) i hjärnan med ipsilaterala cerebral vita substansen skada. Mänskliga PVL inte heller förekomma i total isolering från medföljande grå lesioner. Det kännetecknande för PVL är den relativa, om än inte fullständig, skona av hjärnbarken överliggande de skadade vita substansen - en funktion som vi tror är närvarande i våra musmodeller.
Figur 2. Poängsättning skala från 0-5 för att utvärdera vita substansen skada genom MBP eller O1 i musmodeller av periventrikulär leukomalacia.
Våra musmodeller visar egenskaper PVL på både fenotypisk och molekylär nivå. Vi har använt immuncytokemiska upptäckt av myelin grundläggande protein (MBP) eller O1-antigen för att utvärdera skador, har etablerat en standard skala från 0 till 5 poäng den vita substansen skada (bild 2), och har präglat den vita substansen patologi (Fig . 3). På senare tid har en icke-partisk stereological analys genomförts för att ersätta den första semi-kvantitativ metod. Dessutom, för att testa för korrelat effekterna av vit substans skada på funktionella resultat har vi utfört beteende tester för motorik. Vi har visat att mössen uppvisar slående motoriken i P10-21 efter hypoxi / ischemi plus LPS på P6. Vi har etablerat poäng kriterier med en skala från 0-4 för att definiera kontralaterala extremiteter dysfunktion skadade möss vid P10-21. Normalt kan normala möss kilar upp en 30 ° lutning (poäng av 4) och klättra upp en 45 ° lutning utan att glida (poäng 3). Skadade möss har lägre poäng i korrelation med graden av vit substans skada.
Figur 3. Karakterisering av vit substans skada genom MBP eller O1 färgning och myelin struktur genom elektronmikroskop (EM). MBP och O1 färgning visa myelin förlust i cerebrala vit substans ipsilateralt till ligering, jämfört med kontralaterala vita substansen. EM undersökning visar myeliniserade axoner i hjärnans vita substans kontralateral till ligation och degenererade vävnaden i ipsilaterala vit substans.
Vi räknar med att inrättandet av den nya musmodeller av PVL ger oss möjlighet att studera specifika mekanismer för PVL-liknande skada i den omogna hjärnan. Vi kommer att behandla patogenes med hjälp av transgena musstammar för att undersöka betydelsen av enskilda molekyler av intresse och utvärdera mål för neuroprotektion.
Discussion
Skador på den växande hjärnan leder till förödande neurologiska konsekvenser. Påfallande är mönstret av perinatal hjärnskada starkt åldersberoende. På sikt spädbarn, det påverkar främst hjärnbarken med karakteristiska neuronala förlust. Men i prematura barn, det selektivt påverkar hjärnans vita substans med framstående skada att utveckla oligodendrocyter, kallas en sjukdom periventrikulär leukomalacia (PVL). Omfattningen av problemet med hjärnskada hos prematura barn är extraordinärt. För tidig förlossning och förbättrad neonatal intensivvård har lett till att nästan 90% av överlevnad de 13 miljoner för tidigt födda barn i världen (ca 56 tusen i USA), född årligen med en födelsevikt i 1500 gram, dvs med mycket låg födelsevikt spädbarn. Cirka 10% av de överlevande utställningen därefter cerebral pares och cirka 50% har kognitiva och beteendemässiga underskott. PVL är den viktigaste hjärnan patologi underliggande cerebral pares hos prematura barn. Ingen specifik behandling för PVL finns för närvarande, delvis på grund patogenesen inte har förstått 1,2.
Även om etiologin av PVL är multifaktoriell, hypoxi / ischemi med maternell intrauterin infektion perinatal tros vara en primär orsak till PVL. En hypoxiska / ischemisk modell av PVL hos råtta vid P7 har tidigare fastställts 3. Denna modell är unikt genom att det liknar PVL hos prematura barn. Det kännetecknande för denna modell är selektiv vita substansen patologi, i motsats till majoriteten av stroke modeller som kännetecknas av grå hjärnsubstans infarkt. Bör dock begränsningar i hypoxisk-ischemisk modell i råttan inte förbises. För det första är etiologi PVL är ofta multifaktoriell. Förutom att hypoxi / ischemi, moder till foster infektion / inflammation är starkt förknippat med PVL. Således skulle kombinerad hypoxi / ischemi och infektion / inflammation skapar sannolikt mer PVL-liknande modeller. Den gnagare ålder som bäst korrelerar med människans utveckling under största risken för PVL lesioner (24-32 graviditetsveckor) är postnatal eftersom oligodendroglial differentiering är främst en postnatal händelse i gnagare. Eftersom det är omöjligt att producera en moder till foster infektion / inflammation i postnatala ålder, skulle det vara rimligt att simulera en infektion på en relevant postnatal utvecklingsstadium för att skapa en gnagare modell av PVL. Vi har försökt kombinera LPS injektion med hypoxiska / ischemisk modell i möss vid P6, att producera mer kliniskt relevant PVL lesioner. För det andra kräver den optimala proof-of-concept experimentella strategi för en orsakande roll i en molekyl användning av transgena möss, genetiska manipulationer är mycket svårare hos råtta än i musen. Därför har vi försökt att omvandla vår experimentella modell av PVL från råtta till musen.
Musmodeller av PVL kommer avsevärt att underlätta 1) studier av sjukdomens biologi och patogenes med hjälp av tillgängliga transgen mus stammar, 2) överledning av läkemedelsprövningar för att upptäcka kandidat agenter med terapeutisk potential, 3) testning av nyttan av stamceller med nedsatt immunförsvar musstammar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete är delvis finansierats med bidrag från National Institutes of Health (RO1 NS059043 och RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stiftelsen för anemi Forskning, Feldstein Medical Foundation och Shriners sjukhus för barn.
Vi vill tacka Dr David Njutning för hans förslag. Detta arbete delvis finansierats med bidrag till WD från National Institutes of Health (RO1 NS059043 och RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, och Shriners sjukhus för barn. Vi förklarar inga konkurrerande intressen med anknytning till denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
