Summary
质谱法已被证明是一个有价值的工具，用于分析大型蛋白质复合物的。这种方法使多亚基组件组成，化学计量学和整体结构的见解。在这里，我们所描述的，一步一步，如何执行一个结构性的质谱分析，和特性的大分子结构。
Abstract
活细胞控制和调节生物过程，采取协调一致的行动，通过大量的蛋白质，自己组装成一个阵列的动态，多蛋白质复合物 1 。为了获得各种细胞过程的机械理解，它是至关重要的，以确定这种蛋白复合物的结构，并揭示其组织结构如何决定其功能。多蛋白质复合物的许多方面，但是，难的特点，由于其异质性，非对称结构和动态。因此，新的方法所需的蛋白质组织的三级研究。
新兴的分析大分子复合物的结构生物学工具之一，是质谱（MS）2-5 。这种方法产生复杂的蛋白质组成，亚基的化学计量，和结构拓扑信息。 MS的权力来自其高灵敏度，作为一个结果，样品要求低，从而使内源性水平表达的蛋白质复合物的检查。另一个优点是分析速度，它允许实时反应监测。此外，该技术可以同时测量的特点共存的混合物中单独的人群。
在这里，我们描述了一个详细的协议结构MS分析大蛋白组件的应用程序。程序开始与纳流电喷雾电离（nESI）准备金涂层毛细管。然后，它继续与样品制备，强调一方面应与nESI兼容，并能保持复合物上的其他完好的缓冲液条件。然后，我们解释，一步一步，如何优化高质量测量的实验条件，并获得MS串联质谱图。最后，我们图表中的数据处理和分析，遵循的。而不是试图来描述蛋白质装配的每一个方面，这个协议是介绍了基本的MS程序，使非共价复合物的MS和MS / MS实验的表现。总的来说，我们的目标是提供的主要实验工具的知识，不了解结构MS领域的研究人员。
Protocol
第1部分：纳流电喷雾离子镀金毛细血管的制备
非共价复合物的分析通常是由纳流电喷雾电离（nESI）6，使用玻璃或石英毛细管已拉至一个精尖（〜1微米内径），并涂有导电材料（通常是黄金） 。这样的毛细血管提供现成的使用从商业来源（新目标或Proxeon）;但是，它可以更具成本效益的准备他们在内部：
- 坚持两个带一个双面胶的培养皿中，相距2厘米的底部垫。垫的中心放置一个玻璃棒（8厘米× 5毫米）。胶粘剂垫将于毛细血管，玻璃棒将支持准备的毛细血管，不断突破（图1）的提示。
- 使用硼硅玻璃毛细管，1.0 mm外径× 0.78 mm内径（我们从华纳仪器使用500薄壁硼硅毛细血管包，猫没有。G100TF - 4）。插入一个毛细管进针拉马（我们从萨特仪器有限公司使用的P - 97型）。夹紧毛细管轻轻到位，并调整其位置，使其针拔取器的加热丝的中心所在。轻轻拧紧夹子，直到毛细管两端举行的公司。
- 拉毛细管，使用预定义的程序。每一个毛细管拉会带来两个决赛中，形毛细血管。拉马编程过程的试验和错误之一，直到获得一个可以接受的笔尖形状。我们使用下列程序：
步骤 热 拉 Vell 时间 1 750 - 15 80 2 700 - 15 50 3 750 200 20 80 - 从仪器上取出拉的毛细血管和检查提示，丢弃任何变形或折断。使用钝镊子（我们使用从CK精密定位镊子），放置在培养皿中的毛细血管。基地应重视的毛细血管胶粘剂垫，上部尖朝上，靠在玻璃棒。
- 一旦培养皿满（约80毛细血管成一个直径10厘米的菜适合），插入黄金板块溅射镀膜机（我们使用的模型。EMS550，从环境管理体系）。确保的天然气供应，是根据制造商的指示选择，并激活一个预定义的涂层周期（我们使用氩气压力4磅，在5 × 10 -2毫巴，45毫安目前的真空压力，和涂时间3-6个周期，1分钟，直到毛细血管均匀的黄金）。
第2部分：样品制备
- 微摩尔浓度低的样品（1 - 20微米）。如果有必要，集中使用离心超滤装置（例如，Vivaspin赛多利斯，或NanoSep Pall公司）的样品。建议您验证设备膜蛋白复合物吸附，方可使用。
- 通常情况下，纯化的蛋白复合物的缓冲区或存储解决方案nESI，只有不稳定的解决方案可用于不兼容。因此，缓冲区的交流是必要的。盐，缓冲分子或任何其他非易失性的加合物，如甘油，数码地面电视服务，或EDTA的所有痕迹都将被删除，这关键的一步，决定了光谱的质量。通常情况下，使用醋酸铵水溶液，浓度在5毫米和1米之间，pH值在6-8。缓冲交换，可使用微量凝胶过滤柱（如微型生物自旋层析柱来自Bio - Rad）。此步骤可重复，以最小的稀释1-3倍（小于1.3每台设备的 5倍），直到达到最大交换。如果这两个浓度和缓冲交流是必需的，这可能是一起做，用离心超滤（E，G.，从德国赛多利斯Vivaspin，或NanoSep从Pall公司）。
第3部分：高质量测量的校准质谱仪
多蛋白复合物进行实验，大部分是使用了纳米电四极杆 - 飞行时间（Q - TOF）仪器。建议您使用四极杆质量过滤器调整到低频率，使传输和质量分析离子与高m / z值7,8。这是还建议，添加到仪器的进气口7,8或袖子9中第一个离子指 南，在第一个真空阶段，使压力控制。后者使优化的传输，和非常大的离子7-9脱溶剂。目前，商业ESI - TOF和Q - TOF仪器，可从几个制造商（例如，水域，SCIEX公司，布鲁克，或Agilent），可以修改相对容易和成本效益为母语的MS 应用 7,8， 。这是可能的，但是，使用标准TOF或QTOF配置LCT或QToF1（水域）等仪器获得配合物高达1 MDA的质谱，而不需要修改硬件 5 。
下面列出的协议进行了一个SYNAPT仪器（水域）。
- 纯净水，准备沪深100毫克/毫升的解决方案。 CSI是用于高质量校准，作为单独收取的盐集群（CSI）ñ 铯 +延长超过一个广泛的群众范围内，从393米/ Z以及超过10,000（图2）。
- 使用生硬的镊子，从培养皿和沪深解决方案的负载2μL涂层的毛细管进入毛细血管，使用的Eppendorf GeLoader提示。
- 插入毛细管持有人的毛细血管，并调整这样一种方式，提示是远离持有人的边缘约10毫米的毛细管。
- 手动滑动对毛细管的尖端解决方案，或使用一个自旋向下适配器。
- 置于光学显微镜下的毛细血管和修剪技巧，用锋利的AA型镊子。
- 将毛细管持有人的纳流ES接口。向后旋转XYZ阶段，以避免损坏毛细管，推入其激活的阶段。毛细管应放在第1 - 10毫米锥孔。
- 应用毛细管电压（1450至00年V）和纳流压力低（0.00-0.03栏），直到开始喷，然后尽量减少到最低值的纳流压力。
- 优化调整XYZ阶段的位置，毛细管电压，纳流压力，并脱溶剂气流量的信号强度。
- 要检测的CSI高峰系列宽的质量范围，应优化加速电压（我们使用下列参数：毛细管1.3-1.7千伏，样品锥，锥提取1-3 V 80 - 150V）。
- 为了优化高的质量离子的传输，这就需要温和的去溶剂化条件下，在最初的真空阶段为后盾压力源和分析仪之间，，应提高。这可以通过仔细地减少滚动泵源真空线的电导，部分关闭隔离阀（SpeediValve）。为了确定最佳点，后者应该做的，同时监测信号强度（我们通常使用3.0-6.5毫巴）的效果。
- 收集1次/秒扫描约30，在1000到15000米/ Z m / z为范围
- 收购完成后，校准的飞行时间，使用合适的校准表。
第4部分：完整的蛋白质复合物的质谱分析
- 载入您的样品，（第3部分，第2-5节），并启动喷雾。
- 喷雾的初步优化（第3部分，第6-9）开始，直到检测到的信号。电荷态的确切位置是蛋白依赖，但是，它可以预测，使用离子的质量和平均电荷态之间的关系，从而：（Z AV）10 位 ：Z AV = 0.0778√（M） ，其中m道尔顿复杂的质量。为了防止复杂的解离，不热离子源：开关加热器关闭，或保持温度低于40 ° C。
- 改变毛细管的位置，样品锥和提取电压，以最大限度地提高离子传输，并检查在光谱产生变化。一个可能的出发点可能是锥孔电压100伏，提取锥：1 V，毛细管电压为1.5 kV。优化这些参数，结合纳流压力。
- 为了提高脱溶剂，去掉残留的水和缓冲液成分，增加偏置电压和碰撞单元中的气体压力。这一步应该认真执行，以防止分解的复杂。典型的偏置电压10-100 V的范围内，用1-10毫升/分钟（图3）的陷阱气体流量。手动调节的RF设置和四极剖面可提高传输高质量离子。
- 调整陷阱和转让碰撞能量。通常情况下，需要更高的电压传输高质量离子（通常是10-30 V的范围内）。在这一点上，重要的是要避免碰撞诱导解离的复杂。
- 后一个稳定的信号是Reached，建议纳流压力和毛细管电压下降到最小值，同时保持了稳定的喷雾。
第5部分：串联质谱：游离蛋白复合物
- 已获得最佳的和稳定的信号后，选择一个母离子。设置质量中心和隔离宽度（我们一般用12的LM决议，航模的13至15号决议）。使用宽的质量范围检测高质量/低电荷分解产品。建议您设置的m / z范围内的最高水平，然后降低到所需的值。我们进一步建议叠加MS和MS / MS谱图，以验证所选择的母离子的隔离。
- 要执行的MS / MS，游离于母离子碰撞池的碰撞能量（CE）和压力增加。增加任何陷阱，或逐步转移行政长官在10 - 20V的步骤，和碰撞气体压力提高到0-5毫升/分钟（共同价值观）。最佳激活条件监视器中的光谱变化，直到达到。高活化能可能诱发的一个或多个完整复杂的亚基的解离，并澄清不同的亚基相互作用的亲和力。我们通常使用氩气作为一个陷阱/转移细胞的碰撞气体，虽然已使用较重的气体（如氙或 SF 6）的好处，但是，这些气体都比较昂贵11（图3）。
- 建议选择MS / MS分析一个以上的充电状态。在重叠组件的情况下，购置了一套串联质谱图，将有助于解决不同人群的负责系列。此外，高电荷态会更容易游离于相比，降低电荷态12。
- 除了完整复杂的特征，它会产生较小的解决方案subcomplexes，轻度变性条件下。 subcomplexes的MS和MS / MS分析的形式定义的复杂的亚基 13结构的基础上。亚基亚基相互作用的部分中断，逐渐添加有机溶剂（如甲醇，异丙醇或乙腈）的浓度为50％，或改变溶液的pH值，加入氨甲酸（浓度的4 ％）。
- 要确定的亚基组成的复杂的个人群众，重要的是要变性条件下获得的频谱。这可以使用Zip提示一个25:75的水/乙腈比例 C 4（Millipore公司）作为洗脱溶剂的1％的甲酸，开展。
第6部分：数据处理与分析
- 数据进行离线分析，使用MS谱的谱分析程序。我们通常使用的MassLynx方案（水域）。
- 跨越广泛的m / z范围的光谱，我们建议的高与低的m / z地区应用平滑和质心参数不同的方案，以反映在这些地区的高峰决议的差异。
- 要确定充电系列和计算电荷态和群众，“手册”MassLynx功能可以应用。在复杂的质谱重叠组件的情况下，群众的手工计算可能会更容易。
- 为了方便这些分配过程，可能是额外的软件，例如：MAXENT谱反褶积14峰拟合和模拟15 SOMMS，和分配的组成和化学计量学和蛋白subcomplexes生成蛋白质相互作用网络13,16,17首脑会议。
第7部分：代表结果
图1。准备金涂层纳米电毛细血管。
A.将两个双面胶带到培养皿中，相距2厘米。为了支持准备毛细血管，放置在垫中心玻璃棒（8厘米× 5 mm的）。棒的钝端的准备毛细血管胶粘剂垫，和精益的玻璃棒上的一角。 C.一旦培养皿中充满了黄金与毛细血管的准备，他们的外衣，直到黄金薄膜是均匀分布的毛细血管外表面沉积。
图2。使用碘化铯离子的质量校准 。
沪深大monisotopic集群有它的首选校准质谱仪质谱分析高的复合。等距峰系列扩展到范围很广，远远超过m / z为393万。他们是assigNED单独收取的一般组成（CSI）N CS +盐集群。主要山峰之间的附加 信号的系列双重和三重收取物种造成的; [（CSI）N CS2] 2 +和[（CSI）N CS3] 3 +分别。增加在最初的真空阶段压力检测高大规模集群至关重要。高质谱峰的压力的影响是在小组的一个表现。 和 B。与压力分别为1.2和5.3，readbacks，C 。 在 B扩大质谱。
图3。纳流电的一个五聚体的外源凝集素的质谱。
A.一个外源凝集素的变异复杂的质量法（ 定向进化18 LIB1 - B7所得）上升到3000至5000米/ Z的电荷态分布，但由于离子的不足，脱溶剂，峰广阔。比较显示面板a.和b.增加偏置电压从4V（A）（B）的峰宽至15V的效果。这在加速条件下的增加会导致残留的水和缓冲液成分剥离，产生了高度分辨谱。测得的质量（60240 ± 38大）对应一个五聚体复杂。C. 15充电状态，然后选择串联质谱分析（在B组以灰色阴影。）D。在碰撞能量的增加导致在1,664 m / z为中心的高电荷的单体，和一个精简的四聚体复合物的释放，范围在5000 - 8000米/ Z所有的光谱，获得一个解决方案，20微米的样本含有0.5M醋酸铵。
Discussion
为了获得高品质的光谱应注意的样品制备步骤，其中包括样品的浓度和缓冲交换。稀释的样本，将产生一个低信号，而高度浓缩的样品可以而粘稠，并阻止电针。此外，解决方案，如盐，甘油，洗涤剂，金属离子和还原剂（DTT或β-巯基乙醇）添加剂，往往坚持的外表面的蛋白质，并导致扩大峰。因此，为了实现良好的解决峰，这些组件应在尽可能低的浓度增加。
另一个关键参数是纳升级毛细管的位置，相对质谱仪口。寻找“甜蜜点”可能是对没有经验的用户具有挑战性的，不过，它显着影响光谱的质量。同样重要的是检查纳流毛细管前开始喷。墨滴的大小是一个尖端直径，这应该是〜1μm的的功能。小水滴会导致更有效的电离，因此将是有利的。验证，毛细血管内有没有气泡，可以阻止流动同样重要的是，和黄金涂层不剥离从收购过程中的毛细血管;若有，进一步修剪技巧。请记住，一个样品过量会增加优化MS条件，如毛细管电压，加速电压，压力，碰撞能量的可能性。
总体而言，在协议中所解释的程序已被用于确定大量的蛋白质复合物的成分，化学计量学和结构（见评论2,3,4）。 MDA的大型复合物， 如核糖体的19 高度有序的病毒衣壳20-22，分析，确定底物结合的分子机器23-25 日， 或亚基相互作用网络的特性26,17,16,17,27,28作为但这种方法的价值的几个例子。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢他们的严格审查，并为他们贡献的手稿沙龙组的成员。我们Morasha和Bikura方案，以色列科学基金会（批准号：1823至1807年和378/08），约瑟夫科恩密涅瓦生物膜研究中心，翟氏父子家庭研究员新科学家计划，亚伯拉罕的支持表示感谢索尼娅Rochlin基金会，欧胜家庭慈善信托基金的海伦和米尔顿答Kimmelman中心生物分子结构及组装;什洛莫和萨宾Beirzwinsky房地产; Meil德波顿Aynsley，和Karen暹粒，英国。我们非常感谢给我们的凝集素变种样本丹陶菲克和伊塔马尔Yadid。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-2 μL Volume | Per capillary | ||
| 1-20 μM Concentration | Per complex | ||
| Aquanos volatile buffer such as ammonium acetate at pH= 6- 8 | Typically 5 mM-1 M | ||
| Detergent (Minimal) | Clusters of detergent molecules produce broad and unresolved peaks | ||
| Glycerol (Minimal, up to 5%) | Adheres nonspecifically to proteins and, consequently, broad peaks are observed | ||
| Organic solvents (Up to 50%) | Might denature proteins complexes | ||
| Acids (Up to 4%) | Denature protein complexes | ||
| Salts (Minimal) | Salt adducts lead to broad and unresolved peaks | ||
| DTT (Minimal) | 1-2 μM can be present | ||
| Chelating agents (Minimal) | Above 250 μM lead to extensive adduct formation |
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