Summary
Les aptamères sont sélectionnés par ribo-/deoxyribo-oligonucleotides courte
Abstract
La maladie d'Alzheimer (MA) est une progressive, dépendant de l'âge, maladie neurodégénérative avec une évolution insidieuse qui rend son diagnostic présymptomatique difficiles 1. AD diagnostic définitif est réalisé l'autopsie seulement, établissant ainsi présymptomatique, le diagnostic précoce de la MA est crucial pour développer et administrer des traitements efficaces 2,3.
Amyloïde β-protéine (Aß) est au centre de la pathogenèse AD. Soluble, oligomérique assemblées Aßi auraient des effets sur la neurotoxicité dysfonction sous-jacente synaptique et la perte de neurones dans l'AD 4,5. Diverses formes de Aß solubles assemblées ont été décrits, cependant, leurs interrelations et de la pertinence de l'étiologie et la pathogenèse AD sont complexes et mal comprises 6. Des outils spécifiques de reconnaissance moléculaire peut démêler les relations entre les assemblées Aßi et de faciliter la détection et la caractérisation de ces assemblées au début de l'évolution de la maladie avant que les symptômes apparaissent. La reconnaissance moléculaire s'appuie souvent sur des anticorps. Cependant, une autre classe d'outils de reconnaissance moléculaire, des aptamères, offre des avantages importants par rapport aux anticorps 7,8. Les aptamères sont des oligonucléotides générés par la sélection in vitro: l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) 9,10. SELEX est un processus itératif qui, semblable à l'évolution darwinienne, permet la sélection, d'amplification, d'enrichissement, et la perpétuation d'une propriété, par exemple, avide, ligand spécifique, contraignant (aptamères) ou de l'activité catalytique (ribozymes et ADNzymes).
Malgré l'émergence d'aptamères comme outils de la biotechnologie moderne et la médecine 11, ils ont été sous-utilisés dans le domaine de l'amyloïde. Peu ou ARN aptamères ADNss ont été sélectionnés contre les différentes formes de protéines du prion (PrP) 12-16. Un aptamère ARN générés contre la PrP recombinante bovine a été montré à reconnaître la PrP bovine β-17, une forme soluble, oligomérique, β-feuille riche en variantes de conformation de la PrP pleine longueur qui forme des fibrilles amyloïdes 18. Les aptamères générés en utilisant les formes monomériques et plusieurs de β 2-microglobuline fibrillaire (β 2 m) ont été trouvés pour lier les fibrilles de certaines autres protéines amyloïdogéniques dehors β 2 m 19 fibrilles. Ylera et al. décrit aptamères d'ARN sélectionnés contre immobilisé monomère Aß40 20. De façon inattendue, ces aptamères liés fibrillaire Aß40. Au total, ces données soulèvent plusieurs questions importantes. Pourquoi aptamères sélectionnés contre des protéines monomériques reconnaître leurs formes polymères? Pourriez aptamères contre les formes monomères et / ou oligomères de protéines amyloïdogéniques être obtenus? Pour répondre à ces questions, nous avons tenté de sélectionner des aptamères pour covalente stabilisée oligomères Aß40 21 généré en utilisant la photo-induite de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) 22,23. Similaires aux constatations antérieures 17,19,20, ces aptamères ont réagi avec des fibrilles de Aß et de plusieurs autres protéines amyloïdogéniques susceptible de reconnaître une substance amyloïde potentiellement communes structurelles aptatope 21. Ici, nous présentons la méthodologie utilisée dans la production SELEX de ces aptamères 21.
Protocol
Partie 1: préparation de protéines et de réticulation
Initialement, la protéine utilisée pour SELEX est prétraitée avec 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour obtenir homogène, sans agrégat préparations, comme décrit précédemment 23. Cette étape est nécessaire car pré-formé des agrégats induire l'agrégation rapide des protéines amyloïdogénique, résultant en mauvaise reproductibilité expérimentale 24 ans, et sont indésirables pour la sélection d'aptamères pour le non agrégés, non fibrillaires formes de la protéine.
- Peser ~ 800 pg (~ 180 nmol) pur Aß40 utilisant une microbalance. Transfert du peptide sèche lyophilisée dans étiquetés, siliconé, à faible adsorbant microtubes de 1,6 ml.
- Dissoudre le peptide dans 100% 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP, 400 pi) pour obtenir la solution de 0,5 mM de peptide tel que décrit précédemment 23.
- Diviser cette solution en quatre 100-ul aliquotes de telle sorte que chaque tube contient ~ 45 nmol Aß40 nominalement. Procéder à l'enlèvement de HFIP comme décrit précédemment 23.
- Avant de solubiliser les peptides HFIP-traitées dans le tampon pour les réactions de réticulation, de préparer la réticulation et des réactifs de trempe. Peser le persulfate d'ammonium (APS, MW 228,2 g / mol) et de préparer une solution de 40 mM de phosphate de sodium dans 10 mM, pH 7,4. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Préparer une solution à 2 mM de Tris (2,2-bipyridyle) dichlororuthénium (II) hexahydraté (RuBpy, MW 748.63 g / mol) dans 10 mM phosphate de sodium, pH 7,4. Mélanger à l'aide d'un vortex et de vérifier la dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
- Préparer le réactif de trempe. Peser dithiothréitol (DTT, MW 154,5 g / mol) et se dissolvent dans l'eau déminéralisée ou dans 10 mM-phosphate de sodium, pH 7,4, à 1 M.
- Dissoudre le peptide HFIP-traitée exactement comme décrit précédemment, mais 23,25 pour objectif d'obtenir 60 ~ solution de peptide uM.
- Effectuer PICUP pour générer un mélange d'oligomères Aß40 comme décrit précédemment 23. Une réaction typique est PICUP réalisée dans un volume de 20 ul, où les concentrations finales des protéines, RuBpy, et APS sont de 30 uM, 0,05 mM et 1 mM, respectivement 23. Ici, le mélange utilisé pour PICUP contient 108 ul de protéines, 6 RuBpy ul, 6 APS ul, et DTT 1 pl et la concentration de protéines, RuBpy, et APS sont tous doublés par rapport à la réaction typique. Cela réduit le nombre de réactions PICUP à effectuer et augmente la concentration en protéines pour le dessalage.
Partie 2: dessalage de la préparation de protéines
Avant d'utiliser la protéine pour SELEX, le dessalage est effectué pour éliminer les réactifs de réticulation utilisé pour PICUP. Ce mélange réactionnel PICUP contient les réactifs de réticulation et de protéines ~ uM 55 (concentration nominale).
- Retirez le bouchon haut d'une colonne de dessalage de 5 ml, le soutien de la colonne par un stand, place un bécher en dessous de la sortie de la colonne, et retirez la fiche de sortie. Laissez le flux de stockage tampon et recueillera dans le bécher.
- Equilibrer la colonne en acétate d'ammonium 10 mM, pH 8,3. Ajouter 5 volumes de résine lits (25 ml) de ce tampon en 3 ml aliquotes à la colonne et lui permettre de circuler à travers.
- Pendant ce temps, l'étiquette 8 faible adsorbant, siliconé 1,6 ml tubes et les placer dans un rack tube.
- Après la colonne est équilibrée, appliquer une aliquote de 0,5-0.7-ml de mélange réactionnel PICUP par colonne par utilisation dessalage unique (colonnes peuvent être lavés, stockées et équilibrée pour plus tard utilisations). Laisser le mélange de protéines à tremper dans de la résine de colonne et jeter le flux continu dans le bécher.
- Placer le tube première collection sous la sortie de la colonne. Ajouter 0,5 ml de tampon acétate à la colonne et recueillir les premiers 0,5 ml fraction qui coule à travers.
- Répétez les étapes 2.4 et 2.5, et de recueillir jusqu'à huit fractions de 0,5 ml dans les tubes correspondants.
- Nombre autre série de huit bas-adsorbant, siliconé, petit 0,6 ml tubes et les placer dans un rack. Étiquette d'un autre tube comme «vierge». Sortez 150 ul de chaque fraction et le transfert dans l'étiquette de 0,6 ml tubes. Utilisez 20 ul d'analyse SDS-PAGE (figure 1) comme indiqué précédemment 23.
- Transfert 150 ul d'acétate d'ammonium 10 mM, pH 8,3, dans le tube vide. Utilisez ce tube pour régler la vierge dans un spectrophotomètre.
- Mesurer l'absorbance à 130 ul de chaque fraction à λ = 280 nm dans une cuvette de quartz.
- Après l'absorbance est mesurée, de combiner les fractions les plus riches en protéines (typiquement des fractions 3-5), mélanger délicatement à l'aide d'une pipette, et de garder une partie aliquote de 10 ul pour l'analyse des acides aminés pour déterminer la concentration en protéines (non représentée).
- Diviser l'échantillon en aliquotes multiples de ~ 2 protéines nmol par tube et lyophiliser les échantillons dans un lyophilisateur.
- Après achèvement de lyophilisation, de traiter les échantillons avec HFIP 100% comme avant.
- Stocker les tubes à -20 ° C. Utiliser un tube pour chaque cycle SELEX (ci-dessous).
Partie 3: Amplification de la synthèse de bibliothèques aléatoires ADNss par PCR
La bibliothèque de synthèse ADNss utilisé ici pour SELEX comprenait 49 nucléotides randomisés (A: T: G: C = 25:25:25:25%) flanqué de régions constantes comprenant des sites de clonage (Bam HI, Eco RI) et un promoteur T7, comme décrite précédemment 26.
- Pour amplifier la bibliothèque, mis en place une réaction PCR standard comme suit: 202 ul d'eau déminéralisée, 40 pl de tampon 10x Taq ADN polymérase, deux modèles ul ADNss (0,5 nmol), 120 pl 25 mM MgCl 2, 28 ul 10 mM désoxynucléoside triphosphate mélangez (dNTP), 1 primer ul avant (300 pmol), une amorce réverse ul (300 pmol), et 4 polymérase Taq ul.
- Effectuer la réaction PCR en utilisant un cycleur thermique avec les paramètres suivants: 5 min à 94 ° C pour la dénaturation initiale, 20 cycles chacun de 94 ° C pendant 30 sec, 52 ° C pendant 30 secondes pour le recuit, 72 ° C pendant 30 secondes pour les extension, et l'extension finale à 72 ° C pendant 7 min.
- Après l'achèvement de la réaction PCR, purifier le produit ADN amplifié en utilisant le kit Qiagen QIAquick PCR Purification selon les instructions du fabricant. Généralement, dans ces expériences la concentration et le rendement de l'ADN sont de 160 ± 10 ng / ul dans 50 pi.
- Vérifiez la quantité d'ADN après PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 2%.
Partie 4: Génération de 32 P-ARN marqué par transcription in vitro
- Mettre en place la réaction de transcription dans un O-ring-plafonné, 1,6 ml tube selon les instructions du fabricant, avec quelques modifications comme suit: 20 pl de tampon 5x transcription T7, 7,5 ul chacun des 100 mM, la RATP rGTP, rUTP, 1 pl 100 mM RCTP, 2 pl α 32 P-CTP (3000 Ci / mmol), ug 50-10 purifiée matrice d'ADN (~ 30-40 ul produit purifié l'ADN), 10 ul mélange enzymatique, et porter le volume final de 100 ul en ajoutant une eau sans nucléase.
- Mélanger la solution doucement par une pipette, centrifuger le mélange, et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- A la fin de la réaction, la matrice d'ADN doit être enlevée. Ajouter RQ1 RNase DNase à une concentration de 1 U / ug d'ADN matrice et incuber pendant 4 h à 37 ° C pour digérer la matrice d'ADN.
- Après 4 h, l'extrait de l'ARN en ajoutant 1 volume de citrate de phénol saturé: chloroforme: alcool isoamylique (125:24:1, pH 4,7). Mélanger par un vortex pendant ~ 1 min et centrifuger à 16000 g pendant 2 min.
- Transférer la phase supérieure, aqueuse dans un nouveau tube ou de rejeter la phase inférieure par aspiration à l'aide d'une micropipette. Ajouter 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24:1), mélanger en un vortex pendant 1 min et centrifuger comme décrit en 4.4.
- Transférer la phase supérieure, aqueuse dans un nouveau tube ou de rejeter la phase inférieure par aspiration à l'aide d'une micropipette. Chloroforme résiduels peuvent être éliminés en effectuant une rotation rapide (10 secondes) dans une micro-et la suppression de la phase inférieure avec une micropipette. Dans cette étape, il est plus facile d'éliminer la phase inférieure, plutôt que le surnageant.
- Pour précipiter les ARN, ajoutez 0,1-volume équivalent d'acétate de sodium 3M, pH 5,2, et 1-volume équivalent de 2-propanol. Mélanger et placer dans un congélateur à -20 ° C pendant 15 min.
- Après 15 min, tournent à la vitesse de pointe, de préférence dans une microcentrifugeuse réfrigérés à 4 ° C, pendant 20-30 min pour précipiter le produit ARN.
- Aspirer le surnageant soigneusement, laver le culot d'ARN avec 0,5 ml d'éthanol à 70%, centrifuger à 4 ° C et jeter le éthanol par aspiration.
- Transférer le tube contenant le culot d'ARN à un bloc thermique et sécher les granulés à 37 ° C pendant 5 min.
- Dissoudre l'échantillon d'ARN dans 150 tampon STE mM, pH 8,0 (fourni avec le ProbeQuant illustration G-50 microcolonnes) ou une eau sans nucléase à un volume identique à celui de l'in-vitro réaction de transcription, soit 100 ul (étape 4.1).
- Chauffer le tube contenant le produit d'ARN à 70 ° C pendant 10 min dans un bloc thermique et mélanger en un vortex pour faciliter la dissolution ARN.
- Centrifuger à vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante.
- Gardez une aliquote de 1 ul d'ARN dans une étiquette de 0,6 ml du tube pour le comptage de scintillation et TBE-urée électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Partie 6).
Partie 5: Suppression des nucléotides non constituée en société, le dessalage d'ARN, et comptage à scintillation
Pour supprimer les nucléotides non constituée en société, utilisez deux colonnes G-50 selon les instructions du fabricant.
- Inverser colonnes et mélanger en un tourbillon de remettre en suspension la résine.
- Casser la fermeture bas des colonnes de perforation au moyen de l'outil en plastique fourni dans le kit et assurez vous de laisser la sortie intacte. Desserrer le bouchon un quart de tour et placer les colonnes dans des tubes de collecte de nettoyage fournis dans le G-50 Kit.
- Spin colonnes dans les tubes de prélèvement à 730 g pendant 1 min pour éliminer le tampon de stockage.
- Transfert colonnes à deux nouveaux joints toriques plafonné, 1,6 ml tubes et une charge de 50 ul de 32 P-étiquetés échantillon d'ARN par colonne directement sur la résine sans perturber la résine.
- Centrifuger à 730 g pendant 2 min à collecter l'ARN purifié étiquetés. Après cette étape, jeter les colonnes.
- Transfert 1 pl de G-50-ARN purifié à un tube de 0,6 ml pour le comptage de scintillation et d'électrophorèse (Partie 6). Magasin de stock de l'ARN à -20 ° C jusqu'à leur utilisation pour SELEX. Il est souhaitable que l'ARN est utilisé dans les 2 jours après l'étiquetage afin d'éviter sa dégradation et perte d'activité.
- Utilisez les deux 1-ul aliquotes d'ARN à partir étapes 4,14 et 5,6 pour mesurer les coups par minute (cpm / ul) en utilisant un compteur à scintillation. Ici, nous utilisons le compteur à scintillation Triathler paillasse.
- Transférer les tubes contenant l'échantillon d'ARN à l'intérieur de l'adaptateur en plastique utilisé pour le comptage P 32, fourni avec Triathler. Placer le tube et l'adaptateur à l'intérieur de la chambre de comptage, fermer le couvercle de la chambre, choisir 32 comptant P, et appuyez sur Start pour commencer le comptage.
- Calculez-dire l'incorporation étiquette%, l'incorporation d'% α 32 P-CTP = (cpm / ul pour "G-50" de l'échantillon ÷ cpm / ul pour «TOTAL» de l'échantillon) x 100. Échantillon total est de l'échantillon avant G-50 de purification.
- Après comptage à scintillation et le calcul de l'incorporation pour cent, calculer le rendement de l'ARN et l'activité spécifique de l'ARN. Par exemple, si les chiffres pour un pool d'ARN avant (237 370 cpm / pl) et après G-50 d'épuration (191 330 cpm / ul) l'incorporation de rendement de 81%, puis les suivantes sont calculées avant l'obtention du rendement de l'ARN:
De l'étape 4.1, le montant de α 32 P-CTP à 3000 Ci / mmol et 10 pCi / ul est la suivante:
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Le montant de la CTP sans étiquette utilisée est la suivante:
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Montant total des CTP utilisée est 100006.7pmol. Le poids moléculaire de l'ARN est calculé comme suit
où les 321,45 g / mol 27 est la masse moyenne des rNTP, 100 pb est le nombre de bases dans la séquence, et 17 pb est le nombre de bases dans le promoteur T7 qui ne sont pas transcrites. Soustraction de 61,96 g / mole à partir du poids moléculaire d'oligonucléotides tient compte de l'enlèvement de HPO 2 (63,98) et l'ajout de deux atomes d'hydrogène (2,02) 27. Parce que, sur les 4 rNTP, le CTP est le réactif limitant, si tous les CTP ont été incorporées à la masse théorique de l'ARN produit aurait été:
.
Cependant, en raison de l'incorporation de 81%, cette masse est maintenant 2156 mg. Comtes par ug d'ARN serait alors
où 100 ul est le volume de réaction de transcription, et en termes de moles: 26618,4 g / mol x 8874 cpm / pg = 2.4x10 8 cpm / mol. De là, la quantité d'ARN en nmol et son volume appropriée utilisée pour l'incubation avec la protéine peut être calculé, par exemple, 5 ul d'ARN contiennent ~ 4 nmol ARN, à savoir,
Dans ces expériences, 300 pmol d'une protéine de nmol et 4 nmol à 100 nmol ARN ont été utilisés 21.
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Caractérisation du produit ARN par électrophorèse et autoradiographie: Partie 6
- Pour préparer les échantillons pour l'électrophorèse, l'utilisation des aliquotes de 1 ul d'ARN avant et après G-50 de purification d'étapes 4,14 et 5,6, respectivement. Ajouter 4 tampon STE ul et 5 pi de tampon 2x Novex échantillon TBE-urée.
- Chauffer les échantillons à 70 ° C pendant 5 min comme c'est habituellement recommandé pour électrophorèse ARN (chauffage a été jugée inutile parce que la résolution du gel de l'ARN des échantillons avec et sans chauffage est le même dans cette configuration expérimentale).
- Réunir un 6% TBE-urée-polyacrylamide gel dans l'appareil de gel-course, remplissez l'intérieur et l'extérieur des chambres avec 1x Novex TBE-urée tampon. Rincer les puits du gel préfabriqué en utilisant la mémoire tampon par une pipette de 1 ml.
- Centrifuger les tubes ARN et de charger les échantillons (10 au total ul) en utilisant un gel des conseils de chargement. Exécutez le gel à 180 V pendant 50 min.
- Après 50 min, démonter le gel par briser le moule en plastique, retirez et jetez seulement les plus courts soutien du moule du gel, mais laissez le plus d'accompagnement comme un support pour le gel.
- Nettoyer la surface de la zone de travail avec Decon (ou autre décontaminant de radioactivité approprié) de s'assurer que tous les points contaminant radioactif sont supprimés.
- Disposez deux couches de plastique Saran; envelopper le gel et le support plastique dans l'emballage de deux retors plastique.
- Exposer le gel enveloppés dans du plastique à une feuille d'unutoradiography x-ray film à l'intérieur d'une cassette d'exposition dans la chambre noire, sous la lumière en toute sécurité. Laisser la cassette à -20 ° C pendant 60-90 min.
- Développer le film dans la chambre noire sous un éclairage sûr après 60-90 min en utilisant un développeur automatique du film (figure 2).
Partie 7: l'incubation des protéines ARN et contraignant de filtre
Tout d'abord, l'ARN et les protéines sont incubés dans une solution et ensuite les séquences d'ARN qui se lient à la protéine sont séparés de la non-liants. Comme les cycles de SELEX progrès, liant filtre donnent une indication des protéines ARN d'enrichissement obligatoire.
- Incuber l'ARN à 90 ° C pendant 10 min pour la dénaturation et ensuite à température ambiante pendant 10 min pour la renaturation lente.
- Dissoudre la protéine de l'étape 2.12 de 8 ul de NaOH 60 mM et ajouter 36 ul sans nucléase l'eau déminéralisée. Soniquer le mélange pendant 1 min et ajouter 36 ul d'ARN 2x tampon de liaison (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, pH 7,5).
- Mélanger la quantité appropriée d'ARN avec tampon 20 ul d'ARN 10x contraignants et font monter le volume à 200 pi en ajoutant une eau sans nucléase. Etiqueter le tube "contrôle négatif."
- Mélanger 20 protéines ul et la quantité désirée de l'ARN avec 20 tampons ARN ul 10x contraignants et font monter le volume à 200 pi avec une eau sans nucléase. Etiqueter le tube «réaction».
- Mélanger et incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante. Pendant ce temps préparer les filtres et la configuration du filtre-contraignant pour l'étape suivante.
- Joindre un de 125 ml bras latéral ballon à une prise d'aspiration. Placer un pré-nettoyage, support en verre poreux pour le filtre sur le ballon de bras latéral.
- Equilibrer 3 membranes de filtration dans 2-3 ml d'ARN 1x tampon de liaison dans un plat 35x10 mm Pétri pendant 10-15 min. Le premier filtre sera utilisé pour ajuster l'aspiration par le vide, le second sera utilisé pour l'ARN-seul, témoin négatif contraignante filtre, et le troisième sera utilisé pour la liaison du filtre le mélange ARN-protéine.
- Après 30 min, centrifuger la réaction de liaison et les tubes de contrôle à grande vitesse pendant 5 min à température ambiante.
- Allumez le vide et placer la membrane d'abord sur le verre poreux. Utiliser une micropipette, goutte à goutte 0,5 ml de tampon de liaison ARN sur la membrane et d'ajuster le vide pour permettre l'écoulement lent de chaque goutte de tampon à travers la membrane.
- Placez la seconde membrane sur le verre poreux et en utilisant le même débit, appliquer le contrôle négatif sur la membrane.
- Appliquer 4x0.5 ml aliquotes de 1x ARN tampon de liaison pour laver la membrane et jetez le accréditives. Notez que si la pré-compensation est souhaitée, le flux continu est maintenu pour l'extraction de l'ARN. Pré-compensation supprime des séquences d'ARN qui se lient au filtre.
- Retirer la membrane témoin négatif et le placer dans une conséquence marquée de 1,6 ml du tube pour le comptage de scintillation.
- Remplacer le verre poreux avec une pré-nettoyés support en verre poreux secondes.
- Placer le troisième disque sur le verre poreux et appliquer le mélange réactionnel. Lavez le filtre comme à l'étape 7.11 et jeter le accréditives. Le nombre de lavages peut être augmenté dans les cycles de SELEX tard pour augmenter la rigueur des conditions de SELEX.
- Retirez le disque de filtre et le placer dans un tube de 1,6 ml, étiqueté "mélange réactionnel" et garder pour comptage par scintillation.
- Effectuer le comptage à scintillation comme à l'étape 5.8 et notez les chiffres pour les filtres respectifs.
- Calculer le niveau de la radioactivité du filtre lié par rapport à la quantité totale de radioactivité appliquée aux membranes (reliure%). Cela vous donnera une indication de l'enrichissement obligatoire que progresse SELEX.
Partie 8: extraction d'ARN à partir des filtres
L'ARN est extrait à partir des filtres pour obtenir des séquences qui se lient à la protéine. Ces séquences sont amplifiées pour le cycle de SELEX prochaine.
- Après comptage à scintillation, supprimer la liaison de réaction de filtre du tube (de l'étape 7.15) et le placer dans un endroit propre, sec, 35x10 mm boîte de Pétri.
- Utiliser un scalpel propre et une paire de pinces pour couper la membrane en petits morceaux.
- Utilisation de la pince à épiler, remplacer les pièces coupées de la membrane dans le même tube étiqueté de l'étape 8.1.
- Ajouter 400 ul de tampon d'élution (7 M d'urée, 3 mM d'EDTA, citrate de sodium 100 mM, pH 5,0) et incuber le tube à 95 ° C pendant 10 min.
- Centrifuger le tube à la vitesse supérieure à la température ambiante, aspirer, et de recueillir le beurre d'extraction dans un nouveau tube étiqueté.
- Mesurez le compte radioactivité restant dans le tube contenant les morceaux de membrane par comptage par scintillation pour évaluer l'efficacité de l'extraction.
- Répétez le processus d'extraction (8.4 à 8.6 étapes) trois fois. L'efficacité après trois extractions est généralement ~ 95-96%.
- Dans les tubes contenant les extraits d'ARN, ajouter 1 volume (400 pi) de citrate-saturée (pH 4,7) phénol: chloroforme: alcool isoamylique (125:24:1). Mélanger par un vortex pendant ~ 1 min et centrifugege à 16.000 g pendant 2 min.
- Transférer la phase supérieure, aqueuse dans un nouveau tube ou de rejeter la phase inférieure par aspiration à l'aide d'une micropipette.
- Ajouter 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24:1), mélanger en un vortex pendant 1 min et centrifuger à 16000 g pendant 2 min.
- Transférer la phase supérieure, aqueuse dans un nouveau tube ou de rejeter la phase inférieure par aspiration à l'aide d'une micropipette.
- Pour précipiter les ARN, ajoutez 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, 3-4 glycogène ul (10 ug / ul) que l'ARN coprécipitant, et 1 volume équivalent de 2-propanol. Mélanger et placer dans un congélateur à -20 ° C la nuit.
- Spin à la vitesse supérieure, de préférence dans une microcentrifugeuse à 4 ° C, pendant 20-30 min pour précipiter l'ARN de l'étape 8.12.
- Après centrifugation, l'ARN se sépare en une phase liquide qui est à peine visible. Aspirer le surnageant attentivement sans déloger cette phase à peine visible précipitant au fond du tube.
- Laver les ARN "pellets" avec 0,5 ml d'éthanol à 70%, centrifuger 5 min à la vitesse supérieure à 4 ° C et jeter le éthanol par aspiration sans déloger la phase à peine visible de précipitation.
- Dissoudre le culot d'ARN dans 50 ul de tampon STE et de procéder à G-50 de purification comme dans l'étape 5.
Partie 9: La transcription inverse et PCR pour des cycles de SELEX continue
Pour procéder au prochain cycle de SELEX, l'ARN doit être une transcription inverse de l'ADN et amplifié par PCR.
- En 5 étiqueté 0,6 ml tubes, mélanger 3 pl de la purifier, G-50-dessalé ARN avec 2 pi de 8 fois diluée amorce inversée. «Contrôle négatif." Label d'un tube
- Incuber le mélange à 70 ° C pendant 5 min, puis sur la glace pendant encore 5 min pour permettre l'hybridation de l'amorce sur l'ARN.
- A ce mélange sur la glace, ajouter 6,4 ul eau sans nucléase, 4 pl ImProm-II du tampon de réaction 5X, 1,6 ul 25 mM MgCl 2, 1 pl dNTP 10 mM mélanger, 1 inhibiteur ul Ribonucléase RNasein, 1 pl ImProm-II Reverse Transcriptase soit un total de 15 ul.
- Pour le contrôle négatif, ajouter 7,4 ul eau sans nucléase et laisser de côté la transcriptase inverse. Etiqueter les tubes en conséquence. Le contrôle négatif est inclus pour vérifier que l'ADN contaminant d'un cycle précédent n'est pas amplifié pour le cycle de SELEX prochaine. Cette étape teste l'efficacité de la digestion de la matrice d'ADN par RQ1 RNase DNase à l'étape 4.3.
- Utilisez un cycleur thermique pour incuber le mélange réactionnel à 25 ° C pendant 5 min, 42 ° C pendant 1 h pour le recuit et l'extension du premier brin d'ADN, respectivement, suivis par 70 ° C pendant 15 min pour inactiver la transcriptase inverse.
- Après la transcription inverse, mis en place le mélange PCR. Ajouter 30 ul eau sans nucléase, 10 ul de tampon 10x Taq, 30 pl 25 mM MgCl 2, 7 ul mélange de dNTP 10 mM, 1 ul de chaque amorce, et une polymérase Taq ul dans tous les tubes.
- Exécutez le programme PCR comme dans la partie 3 pour les 9-14 cycles.
- Purifier le produit d'ADN comme dans l'étape 3.3.
- Mélanger 8 ul de produit d'ADN avec l'ADN de chargement 2 colorants ul et électrophorèse sur agarose à 2% à 100 V pendant 15-20 min (figure 3).
- Produit d'ADN est prêt à être transcrit en ARN étiquetés comme dans la partie 4 et utilisées pour le prochain cycle de SELEX.
Partie 10: Résultats Représentant
Dans les expériences de SELEX, la nature des oligomères Aß40 utilisé comme cible, la qualité de l'ARN utilisé pour chaque cycle, et réussi l'extraction d'ARN et d'amplification après chaque cycle sont importantes. Nous avons utilisé pour générer une PICUP oligomères Aß40 mélange pour SELEX après purification et l'élimination des réactifs de reticulation. Les expériences décrites dans le dessalage Partie 2 conduisent généralement à la perte de protéines de 50-55%. La quantité de protéine et de la qualité peut être évaluée en utilisant des mesures d'absorbance (λ = 280) et SDS-PAGE (figure 1). Le profil d'absorbance moyenne de Aß40 éluats de 5 expériences individuelles superposant un typique SDS-PAGE profil de Aß40 élues dans l'une de ces expériences sont présentés dans la figure 1. Les données montrent que la protéine s'élue constamment hors de la colonne en fractions 3-5 et les réactifs de réticulation après éluer la fraction 6 (absorbance augmenté en fraction 7, figure 1). SDS-PAGE montre la distribution des oligomères typiques Aß40 22. Cette distribution est reproductible après les fractions protéiques ont été lyophilisés (2,11), traités avec HFIP (2,11), resolubilisé (7,1), et ré-analysées par SDS-PAGE.
Intégrité de l'ARN pour chaque cycle SELEX est également important pour la progression itérative de SELEX, surtout quand la nucléase sensibles ribo-oligonucléotides sont utilisés. Après amplification de l'ARN et l'étiquetage (partie 4), la qualité des ARN marqués peut être évaluée par électrophorèse sur gel TBE-urée-polyacrylamide. Un profil typique d'un produit intact ARN marqués avant et après G-50 de purification (PArt 5) est montré dans la figure 2.
Après chaque cycle de SELEX, l'ARN est extrait de la membrane après le filtre de liaison (partie 8) et une transcription inverse (partie 9) à l'ADN pour l'amplification PCR (étape 9.5). La matrice d'ADN à partir d'un cycle précédent est ensuite utilisée pour générer 32 P-ARN marqué (partie 4) pour le prochain cycle. Si certains matrice d'ADN contaminant d'un cycle précédent persiste dans le produit d'ARN marqué après des réactions de transcription in vitro (partie 4), l'efficacité des cycles de SELEX sera réduite, en exigeant plus de cycles. Pour contrôler cela, après chaque cycle de SELEX et les correspondants transcription inverse PCR, électrophorèse d'agarose est réalisée (9.12). Absence de produit d'ADN dans les tubes de réaction négative de contrôle (9,4) indique le déplacement réussi de la matrice d'ADN provenant d'un cycle de SELEX précédente (figure 3). Si l'amplification d'ADN par PCR est observée dans le tube témoin négatif, il est conseillé que la durée de l'incubation avec la DNase RQ1 (4,3) soit prolongée. Le fabricant recommande-incubation avec la durée RQ1 DNase est de 15 minutes, cependant, nous avons constaté que plus les incubations (4-5 h) ont été nécessaires pour éliminer complètement la matrice d'ADN (figure 3).
Figure 1. SDS-PAGE et le profil d'absorbance de PICUP-générés, dessalé Aß40 oligomères. Le profil d'absorbance de 5 colonnes individuelles dessalage a été moyennées et recouvert sur un gel de représentant. Des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées sur la droite.
Figure 2. Électrophorèse sur gel TBE-urée-polyacrylamide de produit ARN avant et après G-50 de purification. La direction de migration des produits de la cathode ARN est à l'anode, comme indiqué.
Figure 3. Électrophorèse sur gel d'agarose des produits ADN après transcription inverse et l'amplification par PCR.
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Discussion
Le point de départ du processus SELEX est la synthèse d'une bibliothèque d'oligonucléotides aléatoires contenant typiquement 10 12 -10 15 séquences. Dans l'ADN SELEX, cette bibliothèque est utilisée directement après une piscine ADNss est généré, alors que dans l'ARN SELEX, démontré ici, la bibliothèque ADNss est convertie d'abord à un pool d'ARN enzymatiquement par transcription in vitro. Puis, SELEX est réalisé itérativement lequel chaque cycle comprend l'exposition et la liaison des oligonucléotides à la cible visée, le partitionnement des liants de la non-contraignante des séquences, et l'élution des séquences de liaison. Dans les cycles plus tard, la stoechiométrie de la cible et l'ARN et / ou le nombre de lavages peuvent être modifiés, ou des inhibiteurs compétitifs peuvent être ajoutés dans le tampon de liaison ou de laver à l'augmentation de la sévérité des conditions de SELEX. Filtre de liaison est un classique, une méthode simple, rapide et utilisé pour SELEX 10, bien que de nombreuses méthodes ont été décrites 28 pour la liaison et le partitionnement. Filtre de liaison est idéale pour la capture et la sélection de l'ARN-cible des interactions en solution. Lorsque les objectifs de sélection sont de petites molécules ou des peptides, la taille des pores de la membrane utilisée dans le filtre contraignante devient un facteur limitant et une considération importante.
Après élution, les oligonucléotides cibles contraignantes sont amplifiés et utilisés pour cycles supplémentaires. Lorsque vous utilisez l'ADN SELEX, la piscine enrichi peut être amplifié par PCR directement et utilisé pour le prochain cycle, après la digestion de la séquence complémentaire et de marquage de l'ADN. Lors de l'utilisation d'ARN SELEX, cette piscine doit être converti en ADN par transcription inverse et ensuite amplifié par PCR, transcrits in vitro, et étiquetés à nouveau pour la poursuite du cycle suivant. Habituellement, 8-20 de tels cycles sont nécessaires pour obtenir une piscine enrichi aptamère, ce qui est cloné par la suite et aptamères individuels sont séquencés et caractérisés. Dans les études utilisant des protéines amyloïdes, caractérisation des aptamères est particulièrement important parce que l'affinité intrinsèque d'oligonucléotides pour des structures fibrillaires amyloïdes entrave potentiellement développement des aptamères spécifiques pour les protéines amyloïdes non fibrillaires dans les conditions physiologiques 21. Cette inhérents, la séquence-indépendante affinité des oligonucléotides peuvent avoir conduit à la génération des fibrilles de réaction croisée aptamères dans les études visant à produire des aptamères pour les non-fibrillaire protéines amyloïdogéniques 17,19-21. Récemment, Takahashi et al. Rapportés génération d'aptamères ARN contre un modèle d'oligomères Aß40 et a montré la réactivité avec Aß monomère avec une affinité 29 micromolaires. Toutefois, la réactivité croisée de ces aptamères avec fibrillaire Aß40 ou avec d'autres protéines amyloïdogéniques fibrillaire n'a pas été déterminée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH AG030709 / NIA et 07-65798 du California Department of Public Health. Nous reconnaissons Margaret M. Condron pour la synthèse peptidique et de l'analyse des acides aminés, le Dr Elizabeth F. Neufeld pour les aider et de soutenir les premières étapes du projet, le Dr Chi-Hong Chen B. de fournir un soutien et des réactifs, et le Dr Andrew D . Ellington pour les discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polymerase | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega Corp. | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Can be used under red safe light. |
| Membrane discs | EMD Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR international | 26316-696 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega Corp. | A3802 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
References
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