Summary
Aptamers är korta ribo-/deoxyribo-oligonucleotides väljs av
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv, åldersberoende, neurodegenerativa sjukdomar med en smygande kurs som gör att företagets presymtomatiska diagnosen svår 1. Definitiv AD diagnos uppnås först efter döden, vilket skulle innebära presymtomatiska, tidig diagnos av AD är avgörande för att utveckla och administrera effektiva behandlingar 2,3.
Amyloid β-protein (A-beta) är central AD patogenes. Löslig, oligomeric A-beta församlingar tros påverka neurotoxicitet underliggande synaptiska dysfunktion och neuron förlust i AD 4,5. Olika former av lösliga A-beta-församlingar har beskrivits, men deras inbördes och relevans för AD etiologi och patogenes är komplexa och inte förstått 6. Särskilda molekylär igenkänning verktyg kan reda ut sambanden mellan A-beta-församlingar och underlätta upptäckt och karakterisering av dessa församlingar tidigt i sjukdomsförloppet innan symptomen dyker upp. Molekylär erkännande bygger ofta på antikroppar. Men ett alternativ klass av Molecular Recognition verktyg, aptamers, viktiga fördelar jämfört med antikroppar 7,8. Aptamers är oligonukleotider genereras av in vitro-valet: systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning (SELEX) 9,10. SELEX är en iterativ process som, i likhet med Darwins evolutionslära, gör urval, förstärkning, anrikning och förevigande av en fastighet, t.ex. ivrig, specifika, ligandbindande (aptamers) eller katalytisk aktivitet (ribozymer och DNAzymes).
Trots framväxten av aptamers som verktyg i modern bioteknik och medicin 11, de har varit underutnyttjade inom amyloid området. Få RNA eller ssDNA aptamers har valts ut mot olika former av prionproteiner (PrP) 12-16. En RNA aptamer genereras mot rekombinant bovint PrP visades att känna igen nötkreatur PrP-β 17, en löslig, oligomeric, β-sheet-rika konformationsändringar variant av full längd PrP som utgör amyloidfibrerna 18. Aptamers genereras med hjälp av monomera och flera former av fibrillar β 2-mikroglobulin (β 2 m) konstaterades att binda fibriller av vissa andra amyloidogenic proteiner än β 2 m fibriller 19. Ylera et al. beskrivs RNA aptamers utvalda mot immobiliserade monomera Aβ40 20. Oväntat dessa aptamers bunden fibrillar Aβ40. Sammantaget dessa data upp flera viktiga frågor. Varför aptamers utvalda mot monomera proteiner erkänna sina polymera former? Kunde aptamers mot monomera och / eller oligomeric former av amyloidogenic proteiner erhållas? För att lösa dessa frågor försökte vi att välja aptamers för kovalent stabiliserad oligomeric Aβ40 21 genereras med hjälp av foto-inducerade bryggbindningen av omodifierade proteiner (picup) 22,23. I likhet med tidigare resultat 17,19,20, reagerade dessa aptamers med fibriller av A-beta och flera andra amyloidogenic proteiner kan erkänna ett potentiellt gemensamt amyloid strukturella aptatope 21. Här presenterar vi de SELEX metod som används i produktionen av dessa aptamers 21.
Protocol
Del 1: Protein förberedelse och tvärbindning
Inledningsvis är det protein som används för SELEX förbehandlas med 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) för att erhålla homogen, ballast-fri preparat som beskrivits tidigare 23. Det här steget är nödvändigt eftersom förformade aggregat framkalla en snabb sammanställning av amyloidogenic proteiner, vilket ger dålig experimentella reproducerbarhet 24, och är inte önskvärt för val av aptamers för unaggregated, icke-fibrillar former av proteinet.
- Väg upp ~ 800 mikrogram (~ 180 nmol) ren Aβ40 med hjälp av en mikrovåg. Överför torra frystorkat peptiden i märkta, kisel-belagd, låg adsorbent 1,6 ml mikrofugrör rör.
- Lös upp peptiden i 100% 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP, 400 l) för att erhålla 0,5 lösning mM peptid som beskrivits tidigare 23.
- Dela denna lösning i fyra 100-l alikvoter så att varje rör innehåller ~ 45 nmol Aβ40 nominellt. Fortsätt till borttagande av HFIP som beskrivits tidigare 23.
- Innan solubilizing den HFIP behandlade peptider i buffert för förnätning reaktioner, förbereda bryggbindningen och reagens härdning. Väg upp ammonium persulfate (APS, MW 228,2 g / mol) och förbereda en lösning av 40 mm i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar.
- Förbered 2 mM lösning av Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrat (RuBpy, MW 748,63 g / mol) i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4. Blanda med hjälp av en virvel och verifiera fullständig upplösning. Skydda slangen från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
- Förbered släcka reagens. Väg ditiotreitol (DTT, MW 154,5 g / mol) och lös i avjoniserat vatten eller i 10-mM natriumfosfat, pH 7,4 till 1 M.
- Lös HFIP-behandlade peptid precis som beskrivits tidigare 23,25, men syftet att få ~ 60 lösning mikroM peptid.
- Utför picup att generera en blandning av oligomeric Aβ40 som beskrivits tidigare 23. En typisk picup Reaktionen utförs i en volym på 20 l där den slutliga koncentrationen av protein, RuBpy och APS är 30 mikroM, 0,05 mm och 1 mm, respektive 23. Här finns blandningen används för picup 108 l protein, 6 l RuBpy, 6 l APS, och 1 l DTT och koncentrationen av protein, RuBpy och APS är alla fördubblats i förhållande till den typiska reaktionen. Detta minskar antalet picup reaktioner som ska utföras och ökar proteinkoncentrationen för avsaltning.
Del 2: avsaltning proteinet preparatet
Innan du använder protein för SELEX är avsaltning utförs för att avlägsna bryggbindningen reagens som används för picup. Detta picup reaktionsblandningen innehåller bryggbindningen reagenser och ~ 55 mikroM protein (nominell koncentration).
- Ta bort det övre locket en 5-ml avsaltning kolumnen stödja kolonnen med en monter, placera en bägare under kolumnen utlopp och ta bort utloppspluggen. Låt flödet lagring buffert under och samla i bägaren.
- Jämvikt kolumnen i 10 mM ammoniumacetat, pH 8,3. Tillsätt 5 harts-säng volymer (25 ml) av denna buffert i 3-ml-portioner i kolonnen och låt den rinna igenom.
- Under tiden etiketten 8 låg adsorbent, kisel-belagd 1,6 ml rör och placera dem i ett provrörsställ.
- Efter att kolumnen är jämvikt, tillämpa en 0,5-0.7-ml alikvot av picup reaktionsblandningen per kolumn per enskild avsaltning använder (kolumnerna kan tvättas, lagras och jämvikt för senare användning). Låt proteinblandningens att sjunka ner i kolumnen harts och kassera genomströmning i bägaren.
- Placera den första kollektionen röret under kolumnen utlopp. Tillsätt 0,5 ml buffert acetat i kolonnen och samla de första 0,5 ml-fraktion rinner igenom.
- Upprepa steg 2,4 och 2,5, och samla upp till åtta 0,5 ml-fraktioner i motsvarande rör.
- Antal annan uppsättning 8 låg adsorbent, kisel-belagd, liten 0,6 ml rör och placera dem i ett rack. Etikett ett annat rör som "tomt". Ta ut 150 l av varje fraktion och överföra till den märkta 0,6 ml rör. Använd 20 l för SDS-PAGE analys (Figur 1) som visas tidigare 23.
- Överför 150 l 10 acetat mM ammonium, pH 8,3, i det tomma röret. Använd denna slang för att ställa den tomma i en spektrofotometer.
- Mät absorbansen i 130 l av varje fraktion vid λ = 280 nm i ett kvarts kyvett.
- Efter absorbansen mäts kombinera bråk med den högsta proteinhalten (typiskt fraktioner 3-5), blanda försiktigt med en pipett, och hålla en 10-l Prov för aminosyra analys för att fastställa de faktiska proteinkoncentration (visas inte).
- Dela upp provet i flera portioner av ~ 2 nmol protein per rör och lyophilize proverna i en frystorkning.
- Efter avslutad frystorkning, behandla prover med 100% HFIP som tidigare.
- Förvara rören vid -20 ° C. Använd ett rör för varje SELEX cykel (nedan).
Del 3: Förstärkning av den syntetiska slumpmässiga ssDNA bibliotek med PCR
De syntetiska ssDNA bibliotek som används här för SELEX ingår 49 randomiserade nukleotider (A: T: G: C = 25:25:25:25%) flankeras av konstanta regioner som omfattar kloning webbplatser (Bam HI, Eco RI) och en T7 promotorn, som beskrivits tidigare 26.
- Att förstärka biblioteket, inrätta en standard PCR-reaktion enligt följande: 202 l avjoniserat vatten, 40 l 10x Taq DNA-polymeras buffert, 2 l ssDNA mall (0,5 nmol), 120 l 25 mM MgCl 2, 28 l 10 mM deoxynucleoside trifosfat mix (dNTPs), 1 l framåt grundfärg (300 pmol), 1 l vända grundfärg (300 pmol), och 4 l Taq-polymeras.
- Utför PCR-reaktionen med hjälp av en värmecykeln med följande inställningar: 5 min vid 94 ° C för initial denaturering, 20 cykler vardera 94 ° C i 30 sekunder, 52 ° C i 30 sek för glödgning, 72 ° C i 30 sek för utbyggnad, och slutlig förlängning vid 72 ° C i 7 min.
- Efter slutförandet av PCR-reaktionen, rena förstärkta DNA produkten med Qiagen QiaQuick PCR-rening kit enligt tillverkarens anvisningar. Generellt i dessa experiment koncentration och utbyte av DNA är 160 ± 10 ng / l på 50 l.
- Kontrollera att mängden DNA efter PCR med 2% agarosgelelektrofores.
Del 4: Skapande av 32 P-märkt RNA av in vitro transkription
- Ställ in transkription reaktion i en O-ring-begränsade, 1,6 ml rör enligt tillverkarens anvisningar med några ändringar som följer: 20 l 5x T7 transkription buffert, 7,5 l varje 100 mm RATP, rGTP, rUTP, 1 l 100 mM rCTP, 2 l α 32 P-CTP (3000 Ci / mmol), 5-10 mikrogram renade DNA-mall (~ 30-40 l renat DNA-produkt), 10 l enzym blanda, och späd den slutliga volymen till 100 l genom att lägga nukleasfritt vatten.
- Blanda lösningen försiktigt med en pipett, centrifugera blandningen och inkubera vid 37 ° C över natten.
- I slutet av reaktionen, har DNA-mallen ska tas bort. Lägg RQ1 RNas-fri DNas till en koncentration av 1 U / mikrogram templat-DNA och inkubera i 4 h vid 37 ° C för att smälta de DNA-mall.
- Efter 4 h, extrahera RNA genom att tillsätta 1 del citrat-mättade fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (125:24:1, pH 4,7). Blanda genom en virvel för ~ 1 min och centrifugera vid 16 tusen gram i 2 min.
- Överför det övre vattenfasen till en ny tub eller kasta ner fasen genom aspiration med hjälp av en mikropipett. Tillsätt 1 volym kloroform: Isoamyl alkohol (24:1), blanda med en virvel under 1 minut och centrifugera som beskrivs i 4.4.
- Överför det övre vattenfasen till en ny tub eller kasta ner fasen genom aspiration med hjälp av en mikropipett. Kvarvarande kloroform kan tas bort genom att utföra en snabb spin (10 sekunder) i mikrocentrifug och borttagning av botten fas med en mikropipett. I detta steg är det lättare att ta bort den nedre fasen snarare än supernate.
- Att fälla RNA, lägg till 0,1-volym motsvarande 3M natriumacetat, pH 5,2, och 1-volym motsvarande 2-propanol. Blanda och lägg i en -20 ° C frys i 15 min.
- Efter 15 minuter, snurra i full fart, gärna i en kyld mikrocentrifug vid 4 ° C, för att i 20-30 minuter fällning RNA produkten.
- Aspirera supernate noga, tvätta RNA pellets med 0,5 ml av 70% etanol, centrifugera vid 4 ° C och kasta etanol genom aspiration.
- Överför röret med RNA pelleten i ett värmeblock och torka pellets vid 37 ° C i 5 min.
- Lös RNA-prov på 150 mm STE buffert, pH 8,0 (följer med illustrationen ProbeQuant G-50 microcolumns) eller nukleasfritt vatten till en volym identisk med den för in vitro transkription reaktion dvs 100 l (steg 4,1).
- Värm röret med RNA produkten vid 70 ° C i 10 min i ett värmeblock och blanda med en virvel för att underlätta RNA-upplösning.
- Centrifugera vid högsta hastighet under 1 minut vid rumstemperatur.
- Håll ett 1-l alikvot av RNA i ett märkt 0,6 ml rör för scintillation räkning och TBE-urea polyakrylamidgelelektrofores (Del 6).
Del 5: Borttagning av oregistrerade nukleotider, RNA avsaltning, och scintillations räkna
För att ta bort oregistrerade nukleotider, använda två G-50 kolumner enligt tillverkarens anvisningar.
- Invertera kolumner och blanda med en virvel för att resuspendera harts.
- Bryt av den nedre stängningen av kolonnerna vid perforeringen med plasten verktyget som medföljer satsen och se till att lämna utloppet orörd. Lossa locket ett kvarts varv och placera kolumner i ren samling rör som i G-50 Kit.
- Snurra kolumnerna i samlingen rören vid 730 gi 1 minut för att ta bort lagring buffert.
- Överföring kolumner till två nya O-ring-begränsade, 1,6 ml rör och belastning 50 ìl av 32 P-märkt RNA-prov per kolumn direkt på bas utan störande hartset.
- Snurra på 730 g för 2 min för att samla in det renade märkt RNA. Efter detta steg, kasta kolumnerna.
- Överför 1 l av G-50-renade RNA till ett 0,6 ml rör för scintillation räkning och elektrofores (Del 6). Betesdjur RNA vid -20 ° C fram till användning för SELEX. Det är önskvärt att RNA används inom 2 dagar efter märkningen för att undvika dess försämring och förlust av aktivitet.
- Använd de två 1-l RNA portioner från steg 4,14 och 5,6 för att mäta pulser per minut (CPM / l) med en scintillationsräknare. Här använder vi Triathler bordsskop scintillationsräknare.
- Överför rören som innehåller RNA-prov inuti plastadaptern för 32 P räkna, försedd med Triathler. Sätt slangen och adaptern inne i räknekammare, stäng locket av kammaren, väljer 32 P räkna och tryck på start för att börja räkna.
- Beräkna% dvs etiketten bolagsordning,% införlivandet av α 32 P-CTP = (CPM / l för "G-50" prov ÷ CPM / l "total" sample) x 100. TOTAL provet provet innan G-50 rening.
- Efter scintillation räkna och beräkna procent bolagsordning, beräkna avkastningen av RNA och specifika aktiviteten av RNA. Till exempel, om de står för en pool av RNA före (237.370 kopior / l) och efter G-50 rening (191.330 kopior / l) ger 81% bolagsordning, då följande beräknas före erhålla avkastningen av RNA:
Från steg 4,1, är mängden α 32 P-CTP på 3000 Ci / mmol och 10 μCi / l:
.
Mängden omärkta CTP används är:
.
Totalt antal CTP används är 100006.7pmol. Den molekylvikt av RNA beräknas enligt följande
där 321,45 g / mol 27 är den genomsnittliga vikten på rNTPs är 100 bp antalet baser i sekvensen, och 17 bp är antalet baser i T7 promotor som inte transkriberas. Subtraktion av 61,96 g / mol från oligonukleotiden molekylvikt tar hänsyn till borttagande av HPO 2 (63,98) och tillägg av två väteatomer (2,02) 27. På grund av de 4 rNTPs är CTP den begränsande reagens, om alla CTP skulle införlivas den teoretiska massan av RNA produceras skulle ha varit:
.
Men på grund av 81% bolagsordning, är denna massa nu 2156 mikrogram. Räknar per mikrogram av RNA skulle då vara
där 100 l är transkriptionen reaktionen volym, och i termer av födelsemärken: 26618,4 mikrogram / mikromol x 8874 kopior / mikrogram = 2.4x10 8 kopior / mikromol. Härifrån, mängden RNA i nmol och dess lämplig volym används för inkubation med protein kan beräknas till exempel, kommer 5 l RNA innehåller ~ 4 nmol RNA, dvs
I dessa försök var 300 pmol till 1 nmol protein och 4 nmol till 100 nmol RNA används 21.
. 
. 
. 
Del 6: Karaktärisering av RNA produkt genom elektrofores och autoradiografi
- För att förbereda prover för elektrofores, använd 1-l alikvoter av RNA före och efter G-50 rening från steg 4,14 och 5,6, respektive. Tillsätt 4 l STE buffert och 5 l 2x Novex TBE-Urea Sample buffert.
- Värm proverna vid 70 ° C i 5 min som brukar rekommenderas för RNA-elektrofores (värme visade sig vara onödiga eftersom gelen lösningen av RNA-prover med och utan uppvärmning är detsamma i detta experiment).
- Montera en 6% TBE-urea-polyakrylamidgel i gel-igång apparaten, fylla i och utanför kammare med 1x Novex TBE-Urea löpande buffert. Skölj brunnarna i prefabricerade gelen med hjälp av bufferten med en 1-ml-pipett.
- Centrifugera RNA rören och ladda prover (10 l totalt) med hjälp av gel-lastning tips. Kör gelen vid 180 V under 50 min.
- Efter 50 min, ta isär gelen genom att bryta sönder plast mögel, ta bort och kasta bara kortare stöd av gelen mögel, men låt längre stöd som ett stöd för gelen.
- Rengör ytan på arbetsytan med Decon (eller annan lämplig radioaktivitet saneringsmedel) gör att alla kontaminerande radioaktiva fläckar tas bort.
- Lägg ut två lager av plast Saran wrap, wrap gelen och plasten stöd i de två levererat plastfolie.
- Exponera gelen inlindad i plast för ett ark med enutoradiography röntgenfilm inuti en exponering kassett i det mörka rummet, under säkra ljus. Lämna kassetten vid -20 ° C i 60-90 min.
- Utveckla filmen i det mörka rummet under säkra ljus efter 60-90 min med en automatisk film utvecklare (Figur 2).
Del 7: RNA protein inkubation och filter bindande
Först är RNA och protein inkuberas i lösning och sedan RNA-sekvenser som binder till proteinet är separerade från den icke-pärmar. Som SELEX cykler framsteg, kommer att filtrera bindande ger en indikation av protein RNA-bindande berikande.
- Inkubera RNA vid 90 ° C i 10 min för denaturering och därefter i rumstemperatur i 10 min för långsamma Återställande.
- Lös upp proteinet från steg 2,12 i 8 l 60 mm NaOH och tillsätt 36 l nukleasfritt avjoniserat vatten. Sonikera blandningen i 1 minut och tillsätt 36 l 2x RNA bindande buffert (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, pH 7,5).
- Blanda lämplig mängd RNA med 20 l 10x RNA bindande buffert och göra upp volymen till 200 l genom att lägga nukleasfritt vatten. Märk röret "negativ kontroll."
- Blanda 20 l protein och önskad mängd av RNA med 20 l 10x RNA bindande buffert och göra upp volymen till 200 l med nukleasfritt vatten. Märk röret "reaktion".
- Blanda och inkubera rören i 30 minuter vid rumstemperatur. Under tiden förbereder filter och filtret är bindande setup för nästa steg.
- Bifoga en 125-ml side-arm kolven till ett vakuum inlopp. Placera en förrengöras, porösa glaset stöd för filtret på sidan-arm kolven.
- Jämvikta 3 filter membran i 2-3 ml 1X RNA bindande buffert i en 35x10 mm petriskål i 10-15 min. Det första filtret kommer att användas för att justera vakuum sug, den andra används för RNA-alone, kommer negativ kontroll filter bindande, och den tredje används för filtret bindning av RNA-protein blandning.
- Efter 30 min, centrifugera bindande reaktion och rören kontroll i full fart i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Slå på vakuum och placera det första membranet på porösa glaset. Använd en mikropipett droppa 0,5 ml av RNA-bindande buffert på membranet och justera vakuum för att bromsa flödet av varje buffert droppe genom membranet.
- Placera den andra membranet på porösa glaset och med samma flöde, att tillämpa den negativa kontroll på membranet.
- Applicera 4x0.5 ml alikvoter av 1x RNA bindande buffert att tvätta membranet och kassera genomströmning. Observera att om pre-clearing önskas, är den genomströmning som hålls för RNA-extraktion. Pre-rensa bort RNA-sekvenser som binder till filtret.
- Ta bort den negativa kontroll membranet och placera i en motsvarande-märkt 1,6 ml rör för scintillation räkna.
- Byt ut den porösa glaset med en förrengöras second porösa glaset stöd.
- Placera den tredje skivan på porösa glaset och tillämpa reaktionsblandningen. Tvätta filtret som i steg 7,11 och kasta genomströmning. Antalet tvättar kan ökas senare SELEX cykler för att öka stringensen i SELEX förhållanden.
- Ta bort filtret disk och placera i en 1,6 ml tub märkt "reaktionsblandningen" och hålla för scintillation räkna.
- Utför scintillation räknas som steg 5,8 och anteckna räknas för respektive filter.
- Beräkna nivån på filtret bundna radioaktivitet jämfört med den totala mängd radioaktivitet tillämpas på membran (% bindning). Detta ger en indikation om bindande anrikning som SELEX fortskrider.
Del 8: RNA-extraktion från filtren
RNA extraheras från filtren för att få sekvenser som binder till proteinet. Dessa sekvenser förstärks för nästa SELEX cykel.
- Efter scintillation räkna bort bindande reaktioner filtret från röret (från steg 7,15) och placera i en ren, torr, 35x10 mm petriskål.
- Använd en ren skalpell och en pincett för att skära membranet i små bitar.
- Med hjälp av pincett, Byt ut den skurna bitar av membranet i märkt samma rör från steg 8,1.
- Tillsätt 400 l eluering buffert (7 M urea, 3 mM EDTA, 100 mm natriumcitrat, pH 5,0) och inkubera röret vid 95 ° C i 10 min.
- Centrifugera röret i full fart vid rumstemperatur, aspirera, och samla utvinning smöret i en märkt nytt rör.
- Mät återstående radioaktiviteten räknas i röret med membran stycken av scintillation räkna för att bedöma utvinning effektivitet.
- Upprepa extraktionen processen (steg 8,4-8,6) tre gånger. Effektiviteten efter 3 extraktioner är oftast ~ 95-96%.
- I rören som innehåller RNA-extrakt, tillsätt 1 volym (400 l) av citrat-mättade (pH 4,7) fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (125:24:1). Blanda genom en virvel för ~ 1 min och centrifugeringseffektGE på 16 tusen gram i 2 min.
- Överför det övre vattenfasen till en ny tub eller kasta ner fasen genom aspiration med hjälp av en mikropipett.
- Tillsätt 1 volym kloroform: Isoamyl alkohol (24:1), blanda med en virvel under 1 minut och centrifugera vid 16 tusen gram i 2 min.
- Överför det övre vattenfasen till en ny tub eller kasta ner fasen genom aspiration med hjälp av en mikropipett.
- Att fälla RNA, lägg till 0,1 volym 3 M natriumacetat, pH 5,2, 3-4 l glykogen (10 mikrogram / l) som RNA coprecipitant, och en volym motsvarande 2-propanol. Blanda och lägg i en -20 ° C frys över natten.
- Spin i full fart, gärna i en mikrocentrifug vid 4 ° C, i 20-30 minuter att fälla RNA från steg 8,12.
- Efter centrifugering, separerar RNA i en vätskefas som är knappt synlig. Aspirera supernate försiktigt utan att rubba denna knappt synliga fällningsmedel på botten av röret.
- Tvätta RNA "pellets" med 0,5 ml av 70% etanol, centrifugera 5 min i full fart vid 4 ° C och kasta etanol genom aspiration utan att rubba den knappt synliga fällningsmedel fas.
- Lös upp RNA pelleten i 50 l STE buffert och gå vidare till G-50 rening som i steg 5.
Del 9: omvänd transkription och PCR för fortsatt SELEX cykler
För att gå vidare till nästa cykel av SELEX har RNA vara omvänd transkriberas till DNA och förökas med PCR.
- I 5 märkt 0,6 ml rör, blanda 3 ìl av renade, G-50-desalted RNA med 2 ìl av 8-faldig-utspädd omvänd primer. Märk ett rör "negativ kontroll."
- Inkubera blandningen vid 70 ° C i 5 minuter och sedan på is i ytterligare 5 min så att hybridisering av primer till RNA.
- För att denna blandning på is, lägga 6,4 l nukleasfritt vatten, 4 l ImProm-II 5x reaktion buffert, 1,6 l 25 mM MgCl 2, 1 l 10 mM dNTP mix, 1 l RNasein ribonukleasinhibitor, 1 l ImProm-II omvänt transkriptas som utgör totalt 15 l.
- För den negativa kontrollen, tillsätt 7,4 l nukleasfritt vatten och utelämna de omvänt transkriptas. Märk rören därefter. Den negativa kontrollen ingår att kontrollera att kontaminerande DNA från en tidigare cykel inte är förstärkt för nästa SELEX cykel. Detta steg testar effektiviteten av nedbrytning av DNA-mallen genom RQ1 RNase-fria DNas i steg 4,3.
- Använd en värmecykeln att ruva reaktionsblandningen vid 25 ° C i 5 min, 42 ° C under 1 h för glödgning och utbyggnad av första-DNA, respektive, följt av 70 ° C i 15 min för att inaktivera omvänt transkriptas.
- Efter omvänd transkription reaktion, ställa in PCR-mix. Tillsätt 30 l nukleasfritt vatten, 10 l 10x Taq buffert, 30 l 25 mm 2 MgCl, 7 l 10 mM dNTP mix, 1 l av varje primer och 1 l Taq-polymeras i alla rör.
- Kör PCR-programmet som i del 3 för 9-14 cykler.
- Rena DNA-produkt som i steg 3,3.
- Blanda 8 l DNA-produkt med 2 l DNA laddningsfärg och elektrofores på 2% agaros vid 100 V i 15-20 min (Figur 3).
- DNA-produkt som är redo att skrivas till märkt RNA som i del 4 och som används för nästa cykel av SELEX.
Del 10: representativa resultat
I SELEX experiment, arten av Aβ40 oligomerer som används som mål, kvaliteten på RNA används för varje cykel, och framgångsrika RNA-extraktion och förstärkning efter varje cykel är viktiga. Vi brukade picup att generera en oligomeric Aβ40 blandning för SELEX efter rening och borttagande av bryggbindningen reagenser. Den avsaltning experiment som beskrivs i del 2 leder vanligen till 50-55% protein förlust. Det protein mängden och kvaliteten kan bedömas med hjälp av absorbans mätningar (λ = 280) och SDS-PAGE (Figur 1). Den genomsnittliga absorbans profil Aβ40 eluat från 5 enskilda experiment överliggande en typisk SDS-PAGE profil Aβ40 elueras i ett av dessa experiment visas i figur 1. Uppgifterna visar att proteinet konsekvent eluerar bort kolumnen i fraktionerna 3-5 och bryggbindningen reagenser eluera efter bråkdel 6 (ökad absorbans i bråk 7, figur 1). SDS-PAGE visar den typiska Aβ40 oligomerer fördelningen 22. Denna fördelning var reproducerbara efter protein fraktioner var frystorkat (2,11), behandlade med HFIP (2,11), resolubilized (7,1), och re-analyseras av SDS-PAGE.
Integritet RNA för varje SELEX cykel är också viktigt för iterativ utveckling av SELEX, särskilt när nukleas-känslig Ribo-oligonukleotider används. Efter RNA förstärkning och märkning (del 4), kan kvaliteten på märkta RNA bedömas av TBE-urea-polyakrylamidgelelektrofores. En typisk profil för en märkt intakt RNA produkt före och efter G-50 rening (Pkonsten 5) visas i Figur 2.
Efter varje SELEX cykel är RNA extraheras ur membranet efter filtret bindande (del 8) och omvänd transkriberade (del 9) till DNA för PCR-amplifiering (steg 9,5). DNA-mall från en tidigare cykel används sedan för att generera 32 P-märkt RNA (del 4) för nästa cykel. Om några kontaminerande DNA-mall från en tidigare cykel kvarstår i de märkta RNA produkten efter in vitro transkription reaktioner (del 4), kommer effektiviteten i SELEX cykler sänkas, krävande fler cykler. För att kontrollera detta, efter varje SELEX provcykeln och motsvarande omvänd transkription PCR-reaktion är agaros elektrofores utförs (9,12). Avsaknad av DNA produkt i negativ kontroll reaktionsrören (9,4) indikerar framgångsrika avlägsnande av DNA-mall från en tidigare SELEX cykel (Figur 3). Om DNA-amplifiering med PCR observeras i negativ kontroll röret, är det tillrådligt att varaktigheten av inkubation med RQ1 DNas (4,3) förlängas. Den tillverkande rekommenderas inkubation tid med RQ1 DNas är 15 min, dock fann vi att längre inkubationer (4-5 h) var tvungna att ta bort mallen DNA helt (Figur 3).
Figur 1. SDS-PAGE och absorbans profil picup genereras-, desalted Aβ40 oligomerer. Absorbansen profil från 5 individuella avsaltning kolonner var i genomsnitt och täckta på en representativ gel. Molekylvikt markörer visas till höger.
Figur 2. TBE-urea-polyakrylamidgelelektrofores av RNA-produkten före och efter G-50 rening. Migrationen riktning RNA produkt från katod till anod som anges.
Figur 3. Agarosgelelektrofores av DNA-produkt efter omvänd transkription och PCR-amplifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utgångspunkten för SELEX processen är syntesen av ett slumpmässigt oligonukleotid bibliotek som normalt innehåller 10 12 -10 15 sekvenser. I DNA SELEX är detta bibliotek som används direkt efter en ssDNA pool genereras, medan RNA SELEX, visade här är ssDNA biblioteket konverteras först till en RNA-poolen enzymatiskt av in vitro transkription. Då är SELEX utförs iterativt där varje cykel består av exponering och bindning av oligonukleotider till det avsedda målet, partitionering av bindemedel från icke-bindande sekvenser och eluering av bindande sekvenser. I senare cykler kan stökiometri av målet och RNA och / eller antalet tvättar ändras, eller konkurrerande hämmare kan läggas i bindande eller tvättbuffert för att öka stringensen i SELEX villkoren. Filtrera bindande är en klassisk, enkel och snabb metod som används för SELEX 10, även om många metoder har beskrivits 28 om bindningen och partitionering. Filter bindande är perfekt för att avskilja och val av RNA-målet interaktioner i lösning. När urvalet målen är små molekyler eller peptider, blir porstorlek av membranet används i filtret bindande en begränsande faktor och en viktig faktor.
Efter eluering är målet bindande oligonukleotider förstärks och användas för vidare cykler. Vid användning av DNA SELEX kan det anrikade poolen förökas med PCR direkt och som används för nästa cykel efter rötning av det kompletterande sekvensen och DNA-märkning. När du använder RNA SELEX har denna pool som ska omvandlas till DNA genom omvänd transkription och därefter förökas med PCR, in-vitro transkriberat, och märkt igen för att fortsätta till nästa cykel. Vanligtvis är 8-20 sådana cykler krävs för att få en berikad aptamer pool, som är klonade därefter och enskilda aptamers är sekvenserade och karakteriseras. I studier med hjälp av amyloid protein, karakterisering av aptamers är särskilt viktigt eftersom den inneboende affinitet oligonukleotider för fibrillar amyloid strukturer potentiellt hindrar utveckling av aptamers specifika för icke-fibrillar amyloid protein under fysiologiska förhållanden 21. Denna inneboende, sekvens oberoende affinitet oligonukleotider kan ha lett till generation ROTHÅR-korsreaktiva aptamers i studier som syftar till att generera aptamers för icke-fibrillar amyloidogenic proteiner 17,19-21. Nyligen rapporterade Takahashi et al. Generationen av RNA aptamers mot en oligomeric modell av Aβ40 och visade reaktivitet med monomera A-beta med mikromolära affinitet 29. Emellertid var korsreaktivitet dessa aptamers med fibrillar Aβ40 eller med andra fibrillar amyloidogenic proteiner inte fastställts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag AG030709 från NIH / NIA och 07-65.798 från California Department of Public Health. Vi erkänner Margaret M. Condron för syntes av peptider och aminosyror analys, Dr Elizabeth F. Neufeld för att hjälpa och stödja de första stegen i projektet, Dr Chi-Hong B. Chen för att ge stöd och reagenser, och Dr Andrew D . Ellington för bra diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | |
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | ||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polymerase | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega Corp. | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water |
| α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | |
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Can be used under red safe light. |
| Membrane discs | EMD Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR international | 26316-696 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega Corp. | A3802 | |
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
References
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
