Tumour Murine Bioluminescent כבדית דגם

Summary

מאמר זה מתאר את הליך הגיוס של orthotopic גידולים בכבד bioluminescent בעכברים, ניתוח בדיעבד של הגידול מוגבל בכבד באמצעות הארה חיים שלמים הדמיה הגוף.

Abstract

וידאו זה מתאר את הקמתו של גרורות בכבד במודל של עכברים, כי ניתן לנתח לאחר מכן על ידי הדמיה bioluminescent. תאים Tumour מנוהלים במיוחד כדי לכבד לגרום גידול בכבד מקומי, באמצעות גיוס של הטחול ואת פיצול לשני, והשאיר על כנו את כלי הדם pedicle עבור כל מחצית של הטחול. לואיס לתאי ריאה קרצינומה כי constitutively לבטא את הגן בלוציפראז גחלילית (luc1) הם מחוסן אל הטחול, חמי אחד שהוא resected אז 10 דקות מאוחר יותר. השני חמי הטחול נשאר ללא פגע וחזר הבטן. הגידול בצמיחה הכבד יכול להיות פיקוח על ידי פליטת אור הדמיה באמצעות דימות כולו IVIS מערכת הגוף. הדמיה כמותי של הגידול באמצעות IVIS מספק quantitation המדויק של תאים סרטניים קיימא. תא Tumour מוות נמק עקב טיפול תרופתי מצוין מוקדם על ידי הפחתה של האות bioluminescent. זה מודל העכבר מאפשר לחקור את המנגנונים הישרדות גרורתי גידול תאים וגדילה והוא יכול לשמש לצורך הערכה של הרפוי של גרורות בכבד.

Protocol

הקדמה

הכבד הוא לעתים קרובות את האתר הראשון של מחלה גרורתית וניתן האתר היחיד של התפשטות% כמספר 30 של 40 חולים עם מחלה מתקדמת. עם זאת אפשרויות לטיפול בגידולים בכבד גרורתי מעטים עם מיעוט מהחולים מתאים כריתה ורק 23% המגיבים העיקריים chemotherapeutics. מחקר קליני בתחום זה הוגבל על ידי בהעדר העכבר מודל מתאים ללימוד מחלת כבד מבודד. אנו מתארים גישה מפוצל הטחול כי ניתן להשתמש באופן אמין להקים אחיד, גרורות בכבד מפוזר. כריתה של מחצית זו של הטחול ימנע את ההשלכות של הגידול הטחול ואת החצי השני של הטחול הוא חזר עם מחזור פורטל שלם כדי לשמור על הטחול מאפייני הגנה חיסונית. המודל שאנו מתארים הוא די פשוט לביצוע, ניתן לעשות זאת במהירות דרך חתך אחד בלבד. המאפיינים bioluminescent של קו תאים סרטניים מאפשר כימות מדויק של התגובה לטיפול מבלי להקריב בעלי חיים.

פרוטוקול

I. הכנה Cell

1. לואיס לתאי ריאה קרצינומה גדלים שונה של Dulbecco בינוני חיוניים בתוספת סרום 10% עגל העובר על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו שנקטפו על ידי trypsinisation כאשר תת ומחוברות.
2. תאים נספרו באמצעות Nucleocounter (חמו-metec, דנמרק) ואת השעיית תא בודד של 1 X 10 ⁶ תאים μl 200 הוכן תקשורת חופשית בסרום.

השנייה. עכבר הכנה

הערה: כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של מכללת אוניברסיטת קורק. במעבדה שלנו אנו משתמשים בזריקות הרדמה כדי להרדים את העכבר, לחילופין, ניתן להשתמש הרדמה נשאפים כדי להשיג את אותו אפקט. המתח עכבר השתמשנו הוא שיער MF1 נו / נו המתח המתקבל הרלן מעבדות (אוקספורדשייר, אנגליה). נקבה MF1 נו / נו עכברים במשקל 16-22 גרם של 6-8 שבועות של גיל נכללו בניסוי זה. זנים אחרים כגון C57 ו Balb / C יכול לשמש גם עם שורות תאים מתאים סרטניים.

1. אלחוש נמסר על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין 100ul של 1.5 מ"ג ו 300 xylazine UG.
2. עומק ההרדמה היא הוערכה באמצעות צביטה הבוהן. לא צריך להיות שום נסיגה רפלקס עם קמצוץ הבוהן.
3. עכבר הרדים ממוקם כראוי מודבק על כרית חימום.
4. הבטן היא prepped עם פתרון בבטאדין 10%.
5. הבטן אתר כירורגי הם עטופים בצורה סטרילית.

ג. בטן החתך

1. חתך subcostal קטן עשוי בעור.
2. החתך מורחב 2-3 ס"מ.
3. בטן קיר השרירים חולקו ואת חלל הצפק נכנס.

IV. חשיפה אגף הטחול

1. הטחול הוא לגייס exteriorized בעדינות על גזה מראש לחתוך סטרילית.
2. שני חיבורי אותיות vicryl 4-0 קשורות סביב הגוף באמצע של הטחול.
3. הטחול מחולק בין שני חיבורי אותיות יצירת שני חמי spleens.

V. הזרקת תאים לתוך הטחול, חמי

1. G 27 משמש להזריק נפח 100 μL של תאים לתוך אחד חמי הטחול.
2. תאים Tumour מותר לנקז אל הכבד במשך עשר דקות מתן זמן מספיק עבור רוב התאים מוזרקים להגיע אל הכבד.

VI. כריתה של הטחול, חמי, סגר שחזור בטן

1. מוזרק חמי הטחול הוא נכרת.
2. השני חמי הטחול הוא חזר חלל הבטן.
3. שכבת השריר נסגר עם תפר PDS 4-0 בעזרת תפר פועל פשוט.
4. עור הבטן נסגר עם Prolene 4-0 באמצעות תפרים קטע.
5. בולוס נוזלים מנוהל ואת שלאחר הניתוח כאבים, Carpofen (5 מ"ג / ק"ג) מנוהל על ידי הזרקת IP לניתוח שלאחר 24 שעות.
6. העכבר הוא מותר להתאושש מן ההרדמה

VII. IVIS כל הגוף Bioluminescent הדמיה

1. עכבר הוא מורדם באמצעות הרדמה בזריקות.
2. המצע Luciferin ניתנת על ידי התוך צפקי עשר דקות לפני הזריקה הדמיה
3. עכברים מוצבים על הבמה צילמו דקות 3 IVIS באמצעות המערכת כולה הדמיה הגוף
4. הארה מהכבד ניתן למדוד באמצעות אזור של כלי הריבית

VIII. חשיפה של הכבד העכבר

1. עכבר הוא מורדם באמצעות הרדמה בזריקות.
2. חתך גג בטן מאפשר הדמיה של גרורות בכבד מפוזר in vivo.
3. העכבר הוא מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם והכבד ניתן נכרת לניתוח נוסף.

_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
באיור 1. מטופלים Murine נכרת טרי ואת הגידול הסתננו הכבדים.

איור 2. קינטיקה של גידול בכבד הגידול כפי שמעידים הדמיה IVIS הגוף כולו.

Discussion

התפתחות אמינה במודלים vivo לחקר גרורות בכבד הופך הגדלת חשוב עם כניסתו של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לצורך המחקר מדויק של אסטרטגיות חדשות, במודלים של בעלי חיים צריכים להיות קל יחסית לביצוע, טופס מספר משמעותי של הגרורות, לערב את כל השלבים של מפל גרורתי יש מערכת כתב המאפשר איתור הספירה של מספר מצומצם של תאים גרורתי. הגישה מפוצל טחול כמתואר כרוכה בפעולה אחת היא טכניקה קלה יחסית ללמוד ליצור גרורות בכבד אחיד מפוזר עם סיכון נמוך מאוד של carcinomatosis ו פקקת וריד הפורטל ^1. חלוקת הטחול לשתי חמי spleens לאפשר הזרקת תאים סרטניים לתוך אחד חמי הטחול. תאים Tumour להזין את זרימת הפורטל ולנסוע אל הכבד, מחקה את הצעד הראשון של מפל גרורתי. כריתה של הטחול, חמי מוזרק ימנע את צמיחת הגידול הטחול ואת חזרתם של הטחול, חמי אחרים מבטיחה את השמירה על הנכסים החיסונית הטחול איזו חיה כבר לפני הליך .. מודל זה עשוי להיות מנוצל עבור מגוון רחב של סוגי גידולים. בלוציפראז ריאות לואיס קו התא מאפשרת כימות bioluminescent של מחלת כבד לאורך זמן. רגישות מוגברת של מערכת פליטת אור מאפשר איתור וכימות של מספר קטן של תאים גרורתי. זה מאפשר תזמון מדויק לייזום של פרוטוקולי הטיפול ומאפשר כימות של מחלת כבד ללא הקרבה של החיה. פשטות, עמידות reproducibility דגם זה מתאים ללימוד אסטרטגיות טיפול שונות, כולל רומן chemotherapeutics ^2, ריפוי גנטי ³ ו ^1,4 חיסוני.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc