Summary
ذبابة الفاكهة شنايدر (S2) الخلايا نظام شعبية متزايدة لاكتشاف وتحليل وظيفي من الجينات. هدفنا هو وصف بعض التقنيات التي تجعل الخلايا المجهرية S2 مثل هذا النظام أهمية متزايدة التجريبية.
Abstract
فإن النظام المثالي التجريبية تكون رخيصة وسهلة للحفاظ على ، قابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات ، وسوف تكون معتمدة من قبل دراسات واسعة النطاق وقاعدة بيانات الجينوم التسلسل. مثقف خلايا ذبابة الفاكهة S2 ، نتاج نأت الأجنة 20-24 ساعة قديمة 1 ، تمتلك كل هذه الخصائص. وبالتالي ، فإن خلايا S2 هي غاية مناسبة تماما لتحليل العمليات الخلوية ، بما في ذلك اكتشاف الجينات ترميز المكونات الجزيئية لعملية أو آلية للاهتمام. ملامح من الخلايا التي هي الأكثر S2 المسؤولة عن فائدتها هي السهولة التي يتم الحفاظ عليها ، لحساسيتها بديعة المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل بوساطة الحمض النووي الريبي (دي إس) ([رني) ، وقابلية الإستطراق لالمجهري مضان إما مباشرة أو ثابتة الخلايا.
يمكن زراعة الخلايا S2 في مجموعة متنوعة من وسائل الإعلام ، بما في ذلك عدد من غير مكلفة وسائل الاعلام المتاحة تجاريا المصل الحرة ، كامل المعرفة ، 2. بالإضافة إلى ذلك ، أنها تنمو بشكل أمثل وبسرعة في 21-24 درجة مئوية ، ويمكن تربيتها في مجموعة متنوعة من الحاويات. خلافا لخلايا الثدييات والخلايا S2 لا تتطلب مناخا للوائح ، ولكن بدلا من ذلك بلاء حسنا مع الهواء العادي ، ويمكن أن يستمر حتى في قوارير مختومة.
استكمالا للتخفيف من [رني في الخلايا S2 هو القدرة على تحليل الظواهر بسهولة تجريبيا ، الناجمة عن مرحلة أو مضان المجهري للخلايا الحية أو الثابتة. S2 الخلايا تنمو في الثقافة باعتبارها المونولاير واحد ولكن لا تعرض تثبيط للإتصال به. بدلا من ذلك ، تميل إلى الخلايا تنمو في مستعمرات كثيفة في الثقافات. في منخفض الكثافة ، والثقافات S2 نمت على الزجاج أو البلاستيك نسيج الثقافة المعالجة هي جولة وفضفاضة يعلق. ومع ذلك ، يمكن أن تكون خلايا من خلايا S2 تحسنت كثيرا حثها على نطاق واسع في زراعة تتسطح منهم لفترة وجيزة على السطح المطلي مع lectin ، كونكانافالين A (كونا) 3. ويمكن أيضا أن تكون الخلايا S2 transfected ستابلي مع علامات fluorescently الموسومة للهياكل التسمية أو العضيات الفائدة في الخلايا الحية أو الثابتة. ولذلك ، فإن السيناريو المعتاد لتحليل مجهري للخلايا هو هذا : يتم التعامل مع الأولى ، خلايا S2 (التي يمكن أن تمتلك الجينات المحورة للتعبير عن علامات الموسومة) بواسطة رني للقضاء على البروتين الهدف (ق). يمكن ضبط الوقت رني العلاج للسماح للاختلافات في البروتين بدوره على حركية وتقليل الصدمات خلية / الموت إذا كان الهدف هو بروتين مهم لبقاء. المقبل ، يتم نقل الخلايا المعالجة إلى صحن يحتوي على ساترة قبل المغلفة مع كونا للحث الخلايا على الانتشار والتقيد باحكام الزجاج. أخيرا ، يتم تصوير الخلايا مع اختيار الباحث من وسائط المجهري. S2 خلايا جيدة خاصة بالنسبة للدراسات التي تتطلب رؤية طويلة من الخلايا الحية لأن هذه الخلايا البقاء في صحة جيدة في درجة حرارة الغرفة العادية والغلاف الجوي.
Protocol
1. إعداد S2 الخلايا للفحص المجهري
وكان شنايدر الخلايا المشتقة من الأجنة في وقت متأخر S2 trypsinized أوريجون R ذبابة الفاكهة. وتألفت شنايدر الثقافة الأصلية من خليط من أنواع الخلايا ولكنها أصبحت أكثر تجانسا مع مرور تابع 1. وقد وصفت بأنها كانت تشبه البلاعم (هم أكلة) مع التعبير الجيني كرية دموية شبيهة. ويمكن الحصول على خلايا من ATCC S2 ، DGRC ، أو Invitrogen.
A. اختيار المتوسطة النمو
وقد تم استخدام عدد من وسائل الاعلام الى خلايا الثقافة S2. يذكر أيا من وسائل الإعلام أدناه تتطلب 5 ٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- شنايدر المتوسطة المستخدمة في الأصل لها تعريف (شنايدر ذبابة الفاكهة متوسطة) تستكمل مع مصل الجنين بنسبة 10 ٪ للحرارة المعطل البقري (FBS). بينما FBS يجعل هذه الوسيلة أكثر تكلفة من وسائل الاعلام المصل خالية المذكورة أدناه ، فقد تألق ذاتي منخفضة نسبيا وذلك هو اختيار جيد للepifluorescence المجهري للخلايا الحية. ومع ذلك ، فإنه لا تحتوي على المعادن كافية لتحفيز مستوى منخفض من التعبير عن تلك الجينات المحورة الخاضعة لسيطرة محرض المروج metallothionein (على سبيل المثال ، في ناقلات الجينات subcloned Invitrogen PMT) ، والتسبب في "تسرب" التعبير عن الجين قبل التعريفي.
- مصل عدة خالية من وسائل الاعلام المتاحة تجاريا (مثل Sf900 الثاني ، HyClone SFX الحشرات والحشرات إكسبرس). وسائل الإعلام هذه هي غير مكلفة نسبيا ولكن عادة ما حفز مستويات أعلى من التعبير عند استخدام metallothionein المروج التنظيم الجينات المحورة بالمقارنة مع المتوسط شنايدر. وعلاوة على ذلك ، وهذه تنتج وسائل الإعلام تألق ذاتي كبير مقارنة مع متوسط Schneiders '/ FBS (من الاعتبارات الهامة عند تنفيذ يعيش المجهري مضان الخلية).
- اختياريا ، يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى المتوسطة ، وهذه هي عادة البنسلين G وكبريتات ستربتومايسين (50-100 وحدة / مل و 50-100 ميكروغرام / مل تركيز النهائي ، على التوالي). أيضا ، يمكن إضافة كاشف المضادة للفطريات ، الأمفوتريسين B ، إلى 250 نانوغرام / مل (تركيز النهائي).
شروط باء الثقافة
تتم المحافظة على الخلايا بسهولة تحت درجة حرارة المختبر S2 طبيعية وظروف الجو. عندما يعيش الخلايا S2 التصوير لأوقات طويلة ، الأسباب الرئيسية للموت الخلايا والجفاف والصورة السمية. يتم منع الجفاف بسهولة عن طريق الحفاظ على المتوسط كافية في طبق على المجهر. الصورة سمية هي اصعب مشكلة تتطلب الحد من تعرض الخلايا التراكمية إلى كثافة عالية وعالية الطاقة الضوئية في حين التصوير بشكل متكرر كافية لالتقاط أحداث مثيرة بما يكفي من القرار المكانية والزمانية.
- يتم تقريب S2 المتزايد على الخلايا البلاستيكية عموما وزراعة الأنسجة الملتصقة فضفاضة. تنمو خلايا متكدسة باعتباره أحادي الطبقة الكثيفة ومن ثم ، بشكل متزايد ، أكثر من الخلايا ستنطلق وتنمو في التعليق. المجهري للخلايا كلا ثابتة وحية ، هو تحسن كبير في حالة التصوير التي يسببها الخلايا لتتسطح على قسيمة الغطاء. وصفت هذه الخدعة أدناه (2 ألف 2).
2. الفحص المجهري للخلايا S2
ألف المجهري الخلية الحية
نستخدم المجاهر المقلوب لتصور خلايا S2 يعيش على الزجاج المطلي القاع الأطباق. والأطباق الزجاجية أسفل المبينة أدناه إبقاء الخلايا في حالة مشابهة جدا لحالتها الطبيعية زراعة ، ويسمح أيضا أن يتم فحص الخلايا الحية من خلال الفحص المجهري الصف الزجاج.
- إعداد أطباق زجاجية القاع
المكونات :- Sylgard الاستومر سيليكون 184 طقم
هذا هو الغراء إرفاق زلات لتغطية الأطباق. لديه عدة أجزاء ، وهما المكون الأساس الراتنج وكيل علاج ، والتي هي مختلطة في 10:01 (راتنج : علاج وكيل) نسبة الوزن قبل استخدامها.
لتحضير خليط الراتنج وكيل / علاج :- خارج تزن حوالي 5 غرام من راتنج البلاستيك في وزن القارب. علما الوزن من الراتنج.
- حساب كم هو مطلوب وكيل علاج بضرب الوزن راتنج بنسبة 0.1. إضافة هذا المبلغ لعلاج من وكيل السفينة تزن نفسها باستخدام الماصة نقل جديدة.
- يحرك المزيج جيدا لهذه المكونات. لا تقلق بشأن الفقاعات التي تظهر ، وإنما سوف تختفي ببطء.
- الغراء جاهز الآن. أن لديها مثل الاتساق العسل ، وسوف تكون قابلة للاستخدام لمدة ساعة على الأقل. 5.5 غرام من الغراء يكفي لجعل ما يقرب من 75 الأطباق ، ولكن هذا يعتمد على كيفية بخيل كنت عند تطبيق الغراء.
- البلاستيك 35mm أطباق بتري
نحن لا نستخدم الأطباق الخلية الصف لأن الثقافة لا يهتمون إلا أننا في وجود خلايا نعلق على أسفل الزجاج (وليس من البلاستيك) -- وذلك بدلا نستخدمها ، وأرخص القياسية أطباق بتري. بعض مراحل المجهر والمشابك الدائرية لعقد 35أطباق ملم ، وإذا كان لديك هذا ، تأكد من أن الأطباق الخاصة بك وسوف تتناسب مع المشبك. من المستغرب ، وليس كل الأطباق 35mm لها نفس القطر الخارجي. - غطاء زجاجي
اختيار المناسبة لتغطية زلات المجهر الخاص واحتياجاته. أي شيء من الزجاج التخصص مكلفة مع الصور محفورا الشبكات (مثل العلوم المجهر الإلكتروني ، 23x23 ملم الدائرية ، الشبكية ، العدد 2 ، القط. رقم 72264-23) لأرخص بكثير من الزجاج تغطي الجزء الأكبر (على سبيل المثال ، VWR ، 22x22 ملم مربع من الزجاج ، لا. 1.5 ، يمكن أن تستخدم قط. رقم 48366-227). تحذير : يجب أن يكون الزجاج أكبر قليلا (على الأقل حول 1MM) من الحفرة التي سيتم تقديمها في صحن بيتري ، ويجب أيضا أن يكون أصغر من قطر الطبق. إذا كنت تنوي شراء زجاج مربع ، وتأكد من أن الزجاج سوف تغطي تماما (وتمديد يتجاوز قليلا) ثقب دائري ، ولكن لن تصل الى جانبي الطبق. إذا كنت تفضل لتنظيف الزجاج الخاص الغطاء ، تفعل ذلك قبل الإلتصاق بهم إلى الأطباق. - ثاقب كهربائي
نستخدم الحفر جنب مع متغيرة السرعة وقفل على زر للاستخدام المستمر. أطباق الحفر هو أسهل بكثير مع الصحافة الحفر ، ولكن الانتاج على نطاق صغير من الزجاج القاع أطباق لا يبرر شراء الصحافة الحفر. - قطعة من قماش الدريل القطني
استخدام الأشياء بأسمائها الحقيقية حفر ¾ بوصة بت (هو في الصورة قليلا الأشياء بأسمائها الحقيقية في هذا الموقع : http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). بطبيعة الحال ، فإن قطر بت يحدد القطر من ثقب في أسفل الإناء. - المخروطية مثقاب طحن
استخدام بت مخروطي الشكل طحن مع حصى الخشنة ويبلغ قطرها حوالي نفس بت الأشياء بأسمائها الحقيقية. بعد أن تم حفر جميع الثقوب ، واستخدام هذه بت لمثقب بعيدا شظايا بلاستيكية على حافة الحفرة هذا المشروع من قاع الطبق. سوف شظايا بلاستيكية على الوجه الخارجي للصحن الزجاج غطاء منع من الجلوس مطاردة ضد الطبق. لا تقلق بشأن قطعة بلاستيكية صغيرة الشائكة يصل الى الصحن الداخلي لل: أنها لن تؤثر على تغطية الزجاج أو خلايا. - الستايروفوم مربع بجدران سميكة
كما يتم استخدام هذا السطح الحفر. الغطاء الخارجي جانب واحد من مربع الستايروفوم مع شرائط من الشريط الختم (نستخدم 1.5 بوصة ختم الشريط سكوتش) ، وختم الشريط يقلل من هروب بت الستايروفوم أثناء الحفر.
جمعية- مكان النصف السفلي من طبق بيتري 35mm على سطح مربع مسجلة في الستايروفوم ؛ مكان الطبق حتى هذا الجانب السفلي هو ضد الستايروفوم مربع. في حين عقد على جانبي الصحن بقوة ، من خلال حفر حفرة الطبق. الحذر : أصابعك عقد الطبق سيكون جزءا صغيرا من شبر واحد من مثقاب بالتناوب. بطبيعة الحال ، وهذا أمر خطير. وقف عمليات الحفر اذا طبق تبدأ في الدوران. إذا كان لديك صحافة حفر و / أو وسيلة ذكية لعقد طبق بحزم ، واستخدامها. لدينا لم يكن مجرد حادث ، ولكن هل كل ما تحتاجه لجعل هذا الإجراء آمن.
- بعد حفر جميع أطباق الخاص ، على نحو سلس في الإطار الخارجي من الثقوب باستخدام مثقاب طحن. نضع السلطة الحفر على جانبها ، مع إبراز أصل بت على حافة الطاولة. وعقد الحفر في مكان عن طريق وضع شيء ثقيل ولكن طيعة عليه (نستخدم البلاستيك الثقيلة التي تحتوي على كيس من الرمل 10kg). استخدم زر قفل على إبقاء تشغيل الحفر بشكل مستمر ، ومن ثم تمهيد الحافات من الأطباق كل ما تبذلونه من خلال عقد كل طبق والتحرك ضد بت طحن لضمان سلاسة بعيدا عن حافة خشنة من الحفرة الجديدة.
- تطرح جميع قيعان الطبق في دورق كبير وشطف لهم عدة مرات بالماء المقطر لإزالة الصغيرة ، وقطع من البلاستيك أو فضفاضة الستايروفوم (والتي سوف تطفو). بعد ذلك ، وضع قيعان طبق لتجف.
- عندما الأطباق جافة ، وإعداد الخاص Sylgard 184 الغراء. تطبق دائرة صغيرة من الغراء حول ثقب حفر في السطح الخارجي من كل طبق. وهناك حاجة الغراء ليس كثيرا ، في الواقع ، الكثير من الغراء سيجعل من الفوضى. وضع الزجاج تغطي أكثر من الحفرة ، في اتصال مع الغراء. ينبغي أن تغطي الزجاج الجلوس ضد الطبق بسلاسة وبشكل متساو. إذا لم يكن توزيع الغراء حول الثقب تماما ، ثم قد يكون هناك فجوات صغيرة حيث الغراء مفقود بين الزجاج وتغطي قاع الطبق. في البداية لا تقلق بشأن هذه الثغرات ؛ عادة الغراء وتسلل الى هذه الثغرات لسدها.
- بعد لصق على كل من الزجاج غطاء ، نعود والتحقق من الأطباق لالثغرات التي لم تغلق بواسطة الغراء. في أي فجوة ، وتطبيق الداب صغيرة من الغراء إلى حافة الزجاج بالقرب من تغطية الفجوة ، والغراء والفتيل في هذه الفجوة.
- مجموعة الأطباق جانبا ، والجانب الأسفل إلى الأعلى ، لتجف. وهذا يمكن أن يستغرق يوما أو أكثر في درجة حرارة الغرفة ، ولكن يمكنك زيادة معدل الشفاء من خلال وضع الأطباق في الحاضنة الدافئة.
- إذا كنت في حاجة الأطباق العقيمة ، ووضع أغطية وقيعان طبق في نسيج الثقافة وانتشار غطاء بها. لا تضع أغطية على قيعان الطبق. بدلا من ذلك ، تحويل القطع بحيث سطوحها الداخلية وخيمةتواجه ctly لمبة الأشعة فوق البنفسجية. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية تعقيم ما لا يقل عن 45 دقيقة. إذا كنت تخطط لمعطف كونا الأطباق (أنظر أدناه) ، لا تعقيم الأطباق حتى بعد المغلفة بها.
- أطباق جاهزة الآن للاستخدام.
- Sylgard الاستومر سيليكون 184 طقم
- وباستخدام كونكانافالين
تم العثور على lectin ، كونكانافالين A (كونا) ، لتحفيز الخلايا S2 لتتسطح على سطح مغلفة كونا 3. عندما تكون خلايا المصنف S2 على زلات تغطية المغلفة مع كونا ، فهي تنتشر وتصبح العينات للفحص المجهري ممتازة.- زلات لمعطف كونا غطاء عادي ، انتشر زلات تغطية تنظيفها على رأس قطعة من Parafilm مسجلة أسفل إلى أعلى مقاعد البدلاء. مكان انتشار 10 μLs حل ملغ / مل من 0،5 كونا (في الماء المعقم) على سطح كل زلة تغطية ، ثم المادي على كامل الجزء العلوي من الغطاء زلة. بعد التجفيف ، وتخزين زلات تغطية في وعاء نظيف وجاف. ويمكن تعقيم الزجاج المطلي مع الأشعة فوق البنفسجية في نسيج الثقافة هود.
- لأطباق كونا الزجاج معطف اسفل ، وانتشار مماثل μLs 10 من الحل كونا على الجانب العلوي (أي غطاء التي تواجه الجانب) من الزجاج. بعد التجفيف ، ويمكن تعقيم الأطباق على النحو المبين أعلاه. يتم تخزين كونا المغلفة coverslips الأطباق أو في درجة حرارة الغرفة ، ويمكن استخدامها بعد أشهر التحضير.
- التصوير
- resuspend بلطف خلايا رني المعاملة S2 ونقلها إلى طبق كونا المغلفة بالزجاج القاع ، والتي تحتوي على 2 مل من المتوسط. الخلايا السليمة التي سوف اتصل زلة تغطية كونا المغلفة التقيد باحكام لها والبدء في الانتشار. هذه العملية ينبغي أن تصبح واضحة من قبل نحو 15 دقيقة ، وينبغي أن يكتمل بحلول 45 دقيقة إلى 1 ساعة. لاحظ أن الخلايا لا يمكن أن يعلق تنفيذ الحرائك الخلوية بسبب تمسكهم مشددة على السطح كونا المغلفة ، وسوف تصبح مع مرور الوقت المتعددة الصبغيات. والخلايا في المصنف كونا المغلفة أطباق صحية تبقى لفترات طويلة ، لكنها لن تنتشر في هذه الأطباق.
- بعد أن الخلايا المرفقة ، ويمكن تبادل المتوسطة المدى المتوسط إذا autofluorescent القديم. هذا قد لا يكون من الضروري إجراء دراسات باستخدام المجاهر مبائر أو deconvolution أو المجاهر واسع المجال مع أهداف الأعماق من الميدان الصغير.
- منذ خلايا S2 يتمتعون بصحة جيدة في درجة حرارة الغرفة / الغلاف الجوي العادي ، ثم هناك حاجة لأية شروط أو معدات خاصة عندما كانت الخلايا على المجهر. نحن غالبا ما تأخذ وقت طويل الفاصل بين الأفلام من الخلايا الحية S2. في الممارسة العملية ، يقتصر وقت هذه التجارب من المشاكل المعتادة photobleaching والضيائية.
باء المجهري الخلية الثابتة
- أطباق زجاجية القاع مقابل قسائم تغطية سهل : لا يمكن لأي من هؤلاء أن تستخدم عند تحديد الخلايا. عند استخدام غطاء ينزلق عادي ، مكان واحد زلة تغطية كونا مغلف بالمطاط في صحن an 35mm الفردية (التي لا تحتاج إلى أن يكون نسيج الصف ثقافة) ، إضافة 2 تراخيص وسائل الإعلام ، ومن ثم نقل الخلايا رني المعالجة في الطبق. بعد أن الخلايا التي تعلق على تغطية زلة ، وإزالة المتوسطة ، وغسل الخلايا لفترة وجيزة مع وجود مخزن مؤقت المناسب (PBS يعمل بشكل جيد) ، وإضافة تثبيتي (أنظر أدناه) إلى الطبق. بعد ذلك ، يمكن إزالة الغطاء زلة من الطبق وتجهيز أخرى ، على سبيل المثال ، immunostaining.
- وقد استخدمت مجموعة متنوعة من أساليب لإصلاح الخلايا S2 : التثبيت. وسيتم تحديد أفضل طريقة التثبيت بواسطة مدى نجاح مثبت يحفظ ملامح الفائدة ، ودون تدمير أو فقدان الحواتم الموسومة أو البروتينات. بعض الإجراءات تتطلب خطوة استخراج قبل التثبيت من أجل فضح الحواتم بعض البروتينات الموجودة في الهياكل كثيفة أو المضغوط. منذ الأدب S2 الخلية واسعة النطاق الى حد ما ، فإنه عادة ما يكون من الممكن العثور على وسيلة نشر لإصلاح هيكل أمثل صومعتك S2 المصالح.
- الميثانول هو مثبت مشترك. يجب أن تكون باردة الميثانول (ما لا يقل عن -20 درجة مئوية) واللامائية (يمكن إضافة المناخل الجزيئية [3A نوع] إلى الميثانول في الماء مجردة). نحن البرد حوالى 300 مليليتر من الميثانول اللامائية في كوب زجاج 1L المشمولة في انفجار مانعة للالفريزر 20 درجة مئوية. عندما الميثانول الباردة ، إزالته من الثلاجة ، وإزالة بسرعة متوسطة من صحن زجاجي القاع (أو صحن يحتوي على تغطية زلة) ، ومن ثم يغرق بسرعة الطبق إلى أسفل في الميثانول وتركها هناك. الدورق من الميثانول يحمل عادة نحو عشرة الأطباق. العمل بسرعة والعودة الدورق (التي تحتوي على الأطباق) إلى الثلاجة في أقرب وقت ممكن. اكتمال التثبيت في 10-15 دقيقة. بعد ذلك ، إزالة الأطباق من الكأس ، من اجل الخروج الميثانول المتبقية في أي منها ، وترطيب لهم بإضافة PBS تريتون / 0.1 ٪ X - 100. وهم الآن على استعداد لتلطيخ الاجراءات القياسية.
- الفورمالديهايد آخر مثبت مشترك. نستخدم الفورمالديهايد بنسبة 10 ٪ في المخزن (PBS غير مقبول ، ولكن استخدام العازلة الأكثر ملاءمة لاحتياجاتك). نستخدم هذا التركيز عالية نسبيا من الفورمالديهايد لأن خلايا S2عدم شعيرات متوسطة هيولي من شأنها أن تساعد على خلاف ذلك الحفاظ على التشكل وتنظيم الخلايا أثناء عملية التثبيت.
- تخلصي من تثبيتي في كوب من النفايات وغسل خلايا ثابتة مع ثلاثة يغسل موجز PBST (PBS + 0.1 ٪ TritonX - 100).
- المقبل ، إضافة 1ml بعرقلة حل لهذه الخلايا لمدة 15 دقيقة. نستخدم عادة 5 ٪ مصل الماعز العادية في PBST.
- تخلصي من عرقلة الحل وإضافة الضد الابتدائي (المخفف في عرقلة الحل) مباشرة على الخلايا. وينبغي أن 100 ميكرولتر من محلول الضد تماما تغطي الخلايا. وضع غطاء على طبق بيتري الظهر لمنع التبخر من الحل الأضداد. السماح لاحتضان الضد مع الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الأجسام المضادة وتنفيذ حل يغسل PBST الثلاثة. استخدام الماصة نقلها إلى إضافة 2 مل من PBST إلى الطبق. انتظر 5 دقائق بين كل غسيل (لا حاجة لدوامة الطبق).
- تخلصي من الماضي وغسل إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في عرقلة الحل) مباشرة على الخلايا. وضع غطاء على طبق بيتري الظهر لمنع التبخر من الحل الأضداد. السماح لاحتضان الضد مع الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وأداء ثلاث يغسل 5 دقيقة مع PBST. بعد إغراق غسل الماضي ، إضافة بضع قطرات من سائل الاعلام الخاصة بك لاختيار التركيب مباشرة على الخلايا. نحن نستخدم 0.1 غاللاتي بروبيل M الذائبة في حل من الجلسرين : برنامج تلفزيوني (9:01) وتخزينها في 20 درجة مئوية. استبدال غطاء بيتري وتخزينها في بيئة مظلمة الطبق.
3. قيود / مشاكل
كما هو الحال مع أي نظام التجريبي ، وهناك قيود على استخدام الخلايا S2. الأولى ، خلايا S2 مثقف يحمل عادة مؤشر الإنقسامية منخفضة (حوالي 1 ٪ في مصل خالية من وسائل الإعلام) ، في حين أن مؤشرات الإنقسامية بالنسبة للعديد من خطوط تحويل خلايا الثدييات وتصل إلى 10 أضعاف. لذلك ، لإجراء دراسات الظواهر الإنقسامية والثقافات الخلية S2 تتطلب يعد البحث للعثور على الخلايا بشكل مناسب ، على مراحل. الثاني ، لإجراء دراسات دورة الخلية وأدوية فعالة جدا في إلقاء القبض على خلايا معينة خلال S2 مراحل دورة الخلية. ومع ذلك ، والمركبات التي عكسها الخلية دورة آثار القبض في خلايا الثدييات مثقف لا تبييض بسهولة في الخلايا S2. وبالتالي ، لم بروتوكولات لمزامنة الخلايا المتكاثرة S2 المعمول بها. الثالثة ، والخلايا S2 لا المهاجرة ولا لأنها تكشف عن خصائص بشرية.
4. النتائج المتوقعة
أكبر نقطة بيع لخلايا S2 هي فائدتها كنظام النموذج. انها مفيدة بشكل خاص لتقييم الوظائف الخلوية من البروتين الخاص بك من الفائدة : يتم التعامل مع الخلايا S2 بواسطة رني الرنا المزدوج الجديلة باستخدام ذلك بسهولة (وبأسعار رخيصة نسبيا) توليفها في المختبر ، وأنها تخدم بشكل جيد لتحليل الخلايا الحية والمناعي للخلايا ثابتة . بالإضافة إلى ذلك ، إحدى المزايا الأساسية للخلايا S2 هو السهولة التي يمكن الاحتفاظ بها في المعمل ، وذلك باستخدام مصل غير مكلفة نسبيا وخالية من أي نسيج المتوسطة حاضنة الثقافة.
ومن شأن تجربة نموذجية تشمل طلاء الخلايا S2 في حاوية نسيج الثقافة المناسبة (ويقول ، لوحة 6 أو 96 أيضا) ، واضاف محلية الصنع الرنا المزدوج الجديلة إلى الآبار ، ومن ثم الحفاظ على الثقافات ، ونضبت تدريجيا البروتينات التي تستهدفها رني. اعتمادا على البروتينات الهدف نضبت ، قد تظهر الخلايا تغيير المورفولوجية و / أو السلوكية نتيجة لبروتين هدف الضربة القاضية لأسفل. الوقت اللازم للحد من استهداف بروتين تعبير إلى الحد الأدنى المحددة للبروتين ، وينبغي أن يحدده الغربية النشاف.
عادة خلايا S2 لا تلتزم بإحكام على البلاستيك أو الزجاج ، وهذا من شأنه أن يشكل مشكلة بالنسبة للتجارب التي تتطلب الفحص المجهري للخلايا المعالجة. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب خلايا S2 لتتسطح على نطاق واسع من قبل ببساطة الطلاء على السطح المطلي مع lectin ، كونكانافالين A (كونا). في غضون ساعة من الطلاء على كونا ، فقدت معظم الخلايا مظهرهم تقريب نتيجة لانتشار واسع على سطح كونا (الشكل 1). الخلايا هي الآن على استعداد لمزيد من المعالجة (على سبيل المثال ، عن طريق تثبيت وimmunostaining) أو الملاحظة المجهرية للخلايا الحية.
ويمكن أيضا أن تكون الخلايا S2 transfected (باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف الكيماوية أو electroporation) سواء كانت صريحة إلى عابر جين خارجية أو لدمج ستابلي الجينات في جينوم (وبالتالي خلق خط الخلية التي تحافظ على جينات دخيلة من خلال الانقسامات المتكررة). يمكن أن تخدم أغراضا Transfections كثيرة ، مثل التعبير عن البروتينات fluorescently المفتاحية التي تستخدم هياكل علامة الفائدة الثابتة أو في الخلايا الحية (الشكل 2) ، أو أن كطعم في التجارب المجراة في المنسدلة أو مناعي ، الخ.
ويعتمد أسلوب التحليل ، من فصول التوجيه الجامعيRSE ، فيما يتعلق بمسألة البيولوجية التي تتناولها التجربة. هناك طريقة مشتركة لتحليل الخلايا المعالجة رني S2 هو المناعي للخلايا ثابتة (الشكل 3). على سبيل المثال ، عادة ما تستخدم المناعي مع الجينوم على نطاق شاشات مكتبات الجينات ذبابة الفاكهة لتحديد البروتينات بسرعة مع أنشطة مثيرة للاهتمام في الجسم الحي. ويمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا في وقت واحد خلال استنزاف البروتينات في الخلايا المستهدفة متعددة S2 من أجل دراسة التفاعلات المحتملة بين البروتينات الوظيفية المستهدفة. ويمكن توسيع نطاق التحليل للعيش الخلايا ، لمراقبة تأثير رني على العمليات الحيوية. مرة أخرى ، وخلايا S2 بشكل خاص مناسبة تماما لهذا النوع من التحليل لأنها يمكن أن مطلي على أطباق زجاجية القاع كونا المغلفة وتصور لعدة ساعات على مجهر مقلوب دون الحاجة لغرفة البيئية.
الشكل 1. المرحلة على النقيض من الصور (20X التكبير) من الخلايا S2 بعد الطلاء على طبق زجاج كونكانافالين القاع والمغلفة. الأرقام تشير إلى بعد دقائق من الطلاء. لاحظ أن الخلايا تصبح مرحلة مظلمة كما تتسطح على زلة تغطية المغلفة. خلية تسطيح واضح بنسبة 15 دقيقة (السهام) ، واكتمل بنسبة 60 دقيقة. اللوحة اليمنى : صورة مكبرة من الخلايا المرفق ؛ هوامشها الموسعة وسوت مرئية بوضوح (رأس السهم). مقياس بار (لوحات الاربعة المتبقية) ، و 20 ميكرومتر.
الشكل 2. خلايا S2 transfected عابر مع الانصهار بناء يتألف من nucleophosmin (علامة للنواة) تنصهر في fluorophore ، eGFP (الخضراء). ومطلي هذه الخلايا على طبق من الزجاج قاع كونا المغلفة ، وتصويرها ثم مع مدينة دبي للإنترنت وepifluorescence. مقياس بار ، و 15 ميكرومتر.
immunostained الشكل 3 خلايا لحزب العمال التقدمي S2 الثابتة (أخضر ؛ علامة مريكز). ، ميكروتثبول (الحمراء) ، وهويشت الملطخة (أزرق) للكروموسومات. قبل تثبيت وimmunostaining ، تعرض الخلايا لعلاج لمدة 4 أيام مع رني رني السيطرة أو لضرب أسفل NCD ، وهو بروتين kinesin مثل تعزز قطب المغزل "تركز" 4. لاحظ مفلطحة أقطاب المغزل مغزل وغير منظم في الخلايا تعامل مع رني NCD. مقياس شريط ، و 2.5 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للخلية حقل البيولوجيا ، فإن نظام مثالي للحفاظ على أن تكون غير مكلفة وسهلة التعامل معها ، وقابلة لمجموعة متنوعة من التقنيات. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تلبية هذه الاحتياجات ، وهكذا أصبحت بسرعة هذا النظام خيارا بالنسبة لعدد متزايد من الخلايا مختبرات البيولوجيا.
قدمنا لمحة موجزة عن الأساليب لإعداد الخلايا S2 للفحص المجهري. فضيلة ملحوظ من خلايا S2 هو حقيقة أنها تنمو جيدا في جو طبيعي ودرجة حرارة الغرفة ، وبالتالي ، فإنها يمكن أن تترك على المجهر لفترات طويلة دون أي متطلبات الصيانة الخاصة. على الرغم من أنها عادة ما تكون مقربة الى حد ما وملتصق فضفاضة في ظل ظروف طبيعية زراعة ، يمكن أن يتسبب خلايا S2 لتتسطح على نطاق واسع للتصوير. S2 الخلايا المستزرعة على الزجاج القاع الأطباق التي تم مسبقا مغطاة كونكانافالين وسوف نعلق رقيقة وانتشارها على زلة تغطية ، مما يجعلها ممتازة عينات الفحص المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المعهد الوطني للسرطان P30 CA23074 ، والجمعية الأميركية لأبحاث السرطان المؤسسية 74-001-31 غرانت ، وجامعة ل. من بوغ GI أريزونا (NCI / CA9506O NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
