Summary
Drosophila Schneider (S2) Zellen sind ein zunehmend beliebtes System für die Entdeckung und funktionelle Analyse von Genen. Unser Ziel ist es, einige der mikroskopischen Techniken, die S2-Zellen zu machen, wie eine zunehmend wichtige experimentelle System zu beschreiben.
Abstract
Die ideale experimentelles System wäre billig und leicht zu pflegen, zugänglich für eine Vielzahl von Techniken und würde durch eine umfangreiche Literatur-und Genom-Sequenz-Datenbank unterstützt werden. Cultured Drosophila S2-Zellen, das Produkt der distanzierte 20-24 Stunden alte Embryonen 1, besitzen alle diese Eigenschaften. Folglich sind S2-Zellen extrem für die Analyse von zellulären Prozessen, einschließlich der Entdeckung der Gene, die molekularen Komponenten des Prozesses oder der Mechanismus von Interesse gut geeignet. Die Features von S2-Zellen, die die größte Verantwortung für deren Nutzen sind, sind die Leichtigkeit, mit der sie gehalten werden, ihren exquisiten Sensibilität für doppelsträngige (ds) RNA-Interferenz (RNAi), und ihre Handhabbarkeit zu Fluoreszenzmikroskopie als entweder live oder feste Zellen.
S2-Zellen können in einer Vielzahl von Medien gezüchtet werden, darunter eine Reihe von preiswerten, handelsüblichen, vollständig definierte, Serum-freien Medien 2. Darüber hinaus wachsen sie optimal und schnell auf 21-24 ° C und kann in einer Vielzahl von Containern kultiviert werden. Im Gegensatz zu Säugerzellen tun S2-Zellen benötigen kein geregelter Atmosphäre, sondern tun auch mit normaler Luft und können sogar in verschlossenen Flaschen aufrechterhalten werden.
Ergänzend zu der einfachen RNAi in S2-Zellen ist die Fähigkeit, leicht zu analysieren experimentell induzierten Phänotypen von Phase oder Fluoreszenzmikroskopie von festen oder lebenden Zellen. S2 Zellen wachsen in Kultur als eine einzige Monolage aber nicht angezeigt, wenden Sie Hemmung. Stattdessen neigen Zellen in Kolonien in dichten Kulturen wachsen. Bei geringer Dichte, S2 Kulturen auf Glas-oder Gewebekultur-behandelte Kunststoff gewachsen sind rund und lose befestigt. Allerdings kann die Zytologie von S2-Zellen stark durch die sie dazu veranlassen weitgehend flach durch kurzes kultiviert auf einer Fläche mit dem Lektin Concanavalin A (ConA) 3 beschichtet verbessert werden. S2-Zellen können auch stabil mit Fluoreszenz-markierten Marker zu beschriften Strukturen oder Organellen Interesse an Live-oder fixierten Zellen transfiziert werden. Daher ist das Szenario für die mikroskopische Analyse von Zellen: Erstens, S2-Zellen (die Transgene mit Tags Marker zum Ausdruck besitzen) werden durch RNAi behandelt, um ein Zielprotein (s) zu beseitigen. RNAi-Behandlung Zeit kann eingestellt werden, um Unterschiede in Protein zu ermöglichen turn-over-Kinetik und die Zelle Trauma / Tod zu minimieren, wenn das Zielprotein für die Lebensfähigkeit wichtig. Anschließend werden die behandelten Zellen zu einer Schale mit einem Deckglas vorbeschichtet mit conA, um Zellen zu verbreiten induzieren und fest mit dem Glas haften übertragen. Schließlich werden die Zellen mit dem Forscher die Wahl der Mikroskopie-Modi abgebildet. S2 Zellen sind besonders gut für Studien erfordern erweiterte Visualisierung von lebenden Zellen, da diese Zellen bei Raumtemperatur und normaler Atmosphäre gesund zu bleiben.
Protocol
1. Vorbereitung S2-Zellen für die Mikroskopie
Schneider S2-Zellen wurden aus trypsiniert späten Embryonen von Oregon R Drosophila abgeleitet. Schneider ursprünglichen Kultur bestand aus einer Mischung von Zelltypen, sondern wurde mehr homogen weiterhin Passage 1. Sie haben als Makrophagen-like (sie sind Phagozyten) mit hemocyte wie Genexpression beschrieben worden. S2-Zellen können aus der ATCC, DGRC oder Invitrogen bezogen werden.
A. Auswahl der Wachstumsmedium
Eine Reihe von Medien zur Kultur S2-Zellen verwendet wurden. Keine der genannten Medien unter erfordern eine 5% CO 2-Atmosphäre.
- Schneider ursprünglich ihr definiertem Medium (Schneider Drosophila Medium) mit 10% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) ergänzt. Während FBS dieses Medium teurer als die Serum-freien Medien erwähnt unten macht, hat es relativ geringe Autofluoreszenz und so ist eine gute Wahl für Epifluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen. Allerdings enthält es ausreichend Metall auf ein niedriges Niveau der Expression von denen Transgene unter Kontrolle des induzierbaren Metallothionein-Promotor (zB Gene in Invitrogen pMT subkloniert) stimulieren, so dass "leaky" Expression des Gens vor der Induktion.
- Mehrere serum-freien Medien sind im Handel erhältlich (zB Sf900 II, HyClone SFX-Insect und Insect-Xpress). Diese Medien sind relativ preiswert, aber in der Regel zu stimulieren höhere Ebenen des Ausdrucks bei der Verwendung von Metallothionein-Promotor-regulierten Transgene, wie von Schneider Medium verglichen. Darüber hinaus produzieren diese Medien erhebliche Autofluoreszenz im Vergleich zu Schneiders "mittel / FBS (ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung von Live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie).
- Optional können Antibiotika zum Medium gegeben werden, diese sind in der Regel Penicillin G und Streptomycin-Sulfat (50-100 Einheiten / ml und 50-100 pg / mL Endkonzentrationen jeweils). Auch die Anti-Pilz-Reagenz, Amphotericin B, auf 250 ng / mL (Endkonzentration) zugesetzt werden.
B. Kultur Bedingungen
S2 Zellen sind leicht unter normalen Labor Temperatur und Atmosphäre aufrechterhalten. Bei der Abbildung S2-Zellen für längere Zeit leben, sind die primären Ursachen für den Zelltod Austrocknung und Foto-Toxizität. Dehydration ist leicht, indem sie genügend Mittel in die Schüssel auf dem Mikroskop verhindert. Photo-Toxizität ist ein schwieriger Problem, dass eine Minimierung der Zellen kumulative Exposition mit hoher Intensität, mit energiereichem Licht benötigt, während Bildgebung häufig genug, um interessante Veranstaltungen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung zu erfassen.
- S2-Zellen wachsen auf Gewebekulturen aus Kunststoff sind in der Regel rund und locker anhaftenden. Konfluenten Zellen wachsen als dichte Monoschicht und dann zunehmend mehr Zellen abheben und wachsen in Suspension. Für die Mikroskopie von sowohl fixierten und lebenden Zellen, ist die Bildgebung deutlich verbessert, wenn die Zellen induziert werden, um auf das Deckglas zu glätten. Dieser Trick wird im Folgenden beschrieben (2. A. 2)..
2. Mikroskopie der S2-Zellen
A. Lebend-Zell Mikroskopie
Wir verwenden inverse Mikroskope zu leben S2-Zellen auf Glas-bottom ausplattiert visualisieren. Der Glasboden-Schalen beschrieben werden die Zellen in einem Zustand sehr ähnlich zu ihren normalen Kultivierung Zustand zu halten, und ermöglicht auch lebende Zellen durch Mikroskopie-grade Glas untersucht werden.
- Vorbereitung der Glasboden-Schalen
Komponenten:- Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit
Dies ist der Klebstoff auf die Deckgläser das Geschirr legen. Das Kit verfügt über eine aus zwei Teilen, dem Harz Basiskomponente und Härter, die zu einem 10:1 (Harz: Härter) sind Gewichtsverhältnis kurz vor Gebrauch.
Zur Vorbereitung der Harz / Härter-Gemisch:- Abwiegen etwa 5 g des Harzes in einem Kunststoff wiegen Boot. Beachten Sie das Gewicht des Harzes.
- Berechnen Sie, wie viel Härter durch Multiplikation des Harzes Gewicht um 0,1 erforderlich ist. Fügen Sie diese Menge an Härter auf die gleiche wiegen Boot mit einer neuen Transfer-Pipette.
- Stir zu durchmischen der Komponenten. Mach dir keine Sorgen über die Bläschen, die erscheinen, sie werden langsam verschwinden.
- Der Kleber ist nun bereit. Es hat eine Honig-Konsistenz und nutzbar sein für mindestens eine Stunde. 5,5 g Kleber reicht aus, um rund 75 Gerichte zu machen, aber das hängt wie geizig sind Sie, wenn Sie den Kleber anzuwenden.
- Plastic 35mm Petrischalen
Wir verwenden keine Zellkultur grade Gerichte, weil wir nur in Zellen aufweist, um den Glasboden (und nicht die Kunststoff) legen interessiert sind - so Stattdessen benutzen wir billiger, Standard-Petrischalen. Einige Mikroskoptische haben runde Klammern bis 35 haltenmm Gerichten und wenn du diese haben, stellen Sie sicher, dass Ihr Geschirr wird die Klemme passen. Überraschenderweise nicht alle 35 Gerichte haben den gleichen Außendurchmesser. - Deckglas
Wählen Sie Deckgläschen angebracht, Ihr Mikroskop und Bedürfnisse. Alles, was von teuren Spezialglas mit fotoätzbar Grids (zB Electron Microscopy Sciences, 23x23 mm rund, Gitternetz-Nr. 2, cat. Nr. 72264-23) zu viel billiger bulk Deckglas (zB VWR, 22x22 mm ² Glas , nein. 1,5, cat. Nr. 48366-227) verwendet werden könnte. Achtung: Das Glas muss etwas größer sein (mindestens etwa 1 mm) als das Loch, dass Sie in der Petrischale machen will, und muss auch kleiner als der Durchmesser der Schüssel. Wenn Sie Platz Glas zu kaufen, sicher sein, dass das Glas vollständig abdecken (und erweitern ein wenig darüber hinaus) das runde Loch, aber nicht erreichen wird, die Seiten der Schüssel. Wenn Sie Ihre Deckglas sauber bevorzugen, dies zu tun vor dem Kleben sie an die Gerichte. - Bohrmaschine
Wir verwenden eine Bohrmaschine mit variabler Drehzahl und einem Lock-On-Taste für den Dauereinsatz. Drilling Speisen ist viel einfacher, mit einer Bohrmaschine, aber kleinere Produktion von Glas-bottom Gerichte rechtfertigt nicht den Kauf einer Bohrmaschine. - Bohrer
Verwenden Sie einen ¾-Zoll-Spaten Bohrer (a Spade Bit ist auf dieser Webseite abgebildeten: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). Natürlich bestimmt den Durchmesser des Bohrers der Durchmesser der Bohrung in der Unterseite der Schale. - Kegelmahlwerk Bohrer
Verwenden Sie einen konisch geformten Schleifen bit mit einer groben Körnung und einem Durchmesser ungefähr das Gleiche wie das Spade Bit. Nachdem alle Löcher gebohrt haben gewesen, nutzen dieses Bit auf bur weg Kunststoff-Fragmente an den Rand des Loches, das Projekt aus dem Boden der Schale. Kunststoff-Fragmenten auf der Außenseite der Schale wird das Deckglas aus dem Sitzen vor dem Gericht bündig zu verhindern. Mach dir keine Sorgen kleinen Plastikteile ragte in die Schale im Inneren: Sie hat keinen Einfluss auf das Deckglas oder den Zellen. - Styropor-Box mit dicken Mauern
Dies ist als Bohr-Oberfläche verwendet. Abdeckung einer Außenseite des Styropor-Box mit Streifen Dichtband (wir verwenden 1,5-Zoll-Scotch-Dichtband); die Versiegelung minimiert den Austritt von Bits aus Styropor beim Bohren.
Montage- Legen Sie die untere Hälfte eines 35-mm-Petrischale auf der Styropor-Box ist mit Klebeband Oberfläche; die Schale, so dass seine Unterseite ist gegen die Styropor-Box. Halten Sie die Seiten der Schale fest, bohren ein Loch durch das Gericht. Vorsicht: Ihre Finger halten das Gericht nur einen Bruchteil von einem Zoll werden von einem rotierenden Bohrer. Natürlich ist dies gefährlich. Stop-Bohren, wenn die Schale beginnt sich zu drehen. Wenn Sie eine Bohrmaschine und / oder ein cleverer Weg, um das Gericht fest zu halten haben, nutzen sie. Wir hatten noch nie einen Unfall, sondern tun, was Sie machen dieses Verfahren sicher brauchen.
- Nach dem Bohren alle Ihre Gerichte, glätten die äußere Rand der Löcher mit dem Schleifen Bohrer. Wir stellen die Bohrmaschine auf seiner Seite, mit der Bit-Projektion über den Rand des Zählers. Der Bohrer wird in Position ab, indem etwas schwer, aber geschmeidig auf sie gehalten (wir verwenden eine schwere Plastiktüte mit 10 kg Sand). Verwenden Sie den Lock-On-Taste halten den Bohrer kontinuierlich läuft, und dann glatt die Felgen von allen Gerichten, indem jedes Gericht und bewegte sie gegen die Schleif-bit zu glätten die rauhe Kante des neuen Loch.
- Legen Sie alle Teller Böden in einen großen Becher und spülen Sie sie mehrmals mit destilliertem Wasser auf die kleinen, lose Teile aus Kunststoff oder Styropor (die float) zu entfernen. Danach lag das Gericht Böden zum Trocknen.
- Wenn die Gerichte trocken sind, bereiten Sie Ihre Sylgard 184 Leim. Tragen Sie einen kleinen Kreis von Kleber rund um die Bohrung auf der Außenseite von jedem Gericht. Nicht viel Leim benötigt wird; in der Tat zu viel Kleber wird ein Chaos zu machen. Legen Sie ein Deckglas über dem Loch, in Kontakt mit dem Klebstoff. Das Deckglas sollte gegen die Schale glatt und gleichmäßig sitzen. Wenn der Leim war nicht perfekt um das Loch verteilt, dann gibt es vielleicht kleine Lücken, wo Klebstoff zwischen dem Deckglas und Schalenboden fehlt. Anfangs nicht über diese Lücken Sorge, in der Regel den Leim wird in diese Lücken kriechen, um sie zu füllen.
- Nach dem Verkleben auf allen Deckglas, gehen Sie zurück und überprüfen Sie die Gerichte für Lücken, die nicht durch Kleber wurden geschlossen. Zu jeder Lücke, wenden Sie einen kleinen Klecks Leim an den Rand des Deckglases in der Nähe der Lücke; der Kleber in den Spalt Docht.
- Stellen Sie die Speisen zur Seite, der Unterseite nach oben, um zu trocknen. Dies kann einen Tag oder mehr bei Raumtemperatur, aber Sie können die Härtungsgeschwindigkeit, indem Sie die Gerichte in einer warmen Inkubator zu erhöhen.
- Wenn Sie sterile Gerichte müssen, die Schüssel Boden und Deckel in einer Gewebekultur Kapuze und breitete sie aus. Legen Sie nicht den Deckel auf die Schüssel Böden. Stattdessen schalten die Stücke so, dass ihre Innenflächen dire sindctly vor der UV-Lampe. Schalten Sie die Sterilisation UV-Licht für mindestens 45 min. Wenn Sie ConA Mantel der Gerichte (siehe unten) zu planen, nicht sterilisieren die Gerichte erst, nachdem sie beschichtet werden.
- Die Gerichte sind jetzt einsatzbereit.
- Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit
- Mit Concanavalin A
Die Lektin Concanavalin A (ConA), wurde festgestellt, dass S2-Zellen zu stimulieren, um gegen eine Oberfläche mit ConA 3 beschichtet abzuflachen. Wenn S2 Zellen auf Deckgläser mit ConA beschichtet sind ausgesät, breiteten sie und werden hervorragende Proben für die Mikroskopie.- Um ConA Mantel Ebene Deckgläser, verteilt die gereinigte Deckgläser auf einem Stück Parafilm abgeklebt auf einer Tischplatte. Platz 10 μLs einer 0,5 mg / ml Lösung von ConA (in sterilem Wasser) auf der Oberfläche jedes Deckglas, und breitete sich dann das Material über die gesamte Oberseite des Deckglases. Nach dem Trocknen, speichern Sie die Deckgläschen in einem sauberen, trockenen Behälter. Das beschichtete Glas kann mit dem UV-Licht in einer Gewebekultur Haube sterilisiert werden.
- Um ConA Beschichtung von Glas-bottom Gerichte, ähnlich verteilt 10 μLs der ConA-Lösung auf der Oberseite (dh Deckel zugewandten Seite) des Glases. Nach dem Trocknen kann das Geschirr sterilisiert, wie oben beschrieben werden. ConA-beschichteten Schalen oder Deckgläser sind bei Raumtemperatur gelagert und kann Monate nach Herstellung sein.
- Imaging
- Vorsichtig resuspendieren RNAi-behandelten S2-Zellen und Übertragung auf einen ConA-beschichtet, Glas-bottom Schale mit 2 ml Medium. Gesunde Zellen, die die ConA-beschichteten Deckgläschen Kontakt wird strikt einzuhalten, um es und beginnen sich zu verbreiten. Dieser Prozess sollte sich um ca. 15 min deutlich und sollte um 45 min bis 1 h vollständig. Beachten Sie, dass anhaftenden Zellen können keine Zytokinese aufgrund ihrer engen Bindung an die ConA-beschichtete Oberfläche und wird polyploiden im Laufe der Zeit. Zellen in ConA-beschichteten Schalen ausgesät bleiben für längere Zeit gesund, aber nicht vermehren sich in diesen Gerichten.
- Nachdem die Zellen angeschlossen haben, kann das Medium ausgetauscht, wenn das alte Medium ist autofluoreszierenden werden. Dies kann nicht notwendig sein, für Studien mit Hilfe der konfokalen oder Dekonvolution Mikroskopen oder Weitwinkel-Mikroskope mit kleinen Tiefen-of-field Ziele.
- Da S2 Zellen bei Raumtemperatur / normale Atmosphäre, sind gesund dann keine besonderen Bedingungen oder Geräte werden benötigt, wenn die Zellen unter dem Mikroskop sind. Wir nehmen oft lange Zeitraffer-Filme von Live-S2-Zellen. In der Praxis ist die Laufzeit dieser Experimente mit den üblichen Problemen der Bleichen und Phototoxizität begrenzt.
B. Feste Zellmikroskopie
- Glass-bottom Gerichte vs Ebene Deckgläser: Entweder dieser kann bei der Festsetzung der Zellen sein. Bei Verwendung von Normalpapier Deckgläser, statt einer einzigen ConA-beschichteten Deckgläschen in eine individuelle 35mm Schale (die müssen nicht Gewebekultur grade sein), fügen Sie 2 ml der Medien, und übertragen Sie dann die RNAi-behandelten Zellen in die Schüssel. Nachdem sich die Zellen auf dem Deckglas angeschlossen haben, entfernen Sie das Medium, kurz waschen Sie die Zellen mit einem geeigneten Puffer (PBS gut funktioniert), und fügen Sie die Fixierlösung (siehe unten) in die Schale. Danach kann das Deckglas aus der Schale entfernt werden und weitere, zum Beispiel durch Immunfärbung verarbeitet.
- Fixation: Eine Vielzahl von Methoden wurden verwendet, um S2 Zellen zu fixieren. Die beste Fixierung Methode wird, wie gut ein Fixiermittel konserviert interessierenden Merkmale ermittelt werden, ohne sie zu zerstören oder zu verlieren Epitope oder markierte Proteine. Einige Verfahren erfordern einen Extraktionsschritt vor der Fixierung, um die Epitope von einigen Proteinen in dichten oder kompakte Strukturen befindet sich aussetzen. Da die S2-Zelle Literatur ist ziemlich umfangreich, ist es meist möglich, einer publizierten Methode optimal fixieren Sie Ihre S2 Zellstruktur von Interesse zu finden.
- Methanol ist ein gemeinsames Fixativ. Das Methanol sollte kalt (mindestens -20 ° C) und wasserfrei (Molekularsieben [Typ 3A] kann, um das Methanol zu abstrahieren Wasser hinzugefügt werden). Wir chillen ca. 300 ml wasserfreiem Methanol in einem bedeckten 1L Becherglas in einem explosionsgeschützten 20 ° C Gefrierschrank. Wenn das Methanol kalt ist, entfernen Sie sie aus dem Gefrierschrank, schnell zu entfernen, das Medium aus dem Glasbodenboot Schale (oder Teller mit einem Deckglas), und dann schnell stürzen die Schale nach unten in den Methanol und lassen Sie ihn dort. Der Becher von Methanol in der Regel hält etwa ein Dutzend Gerichte. Arbeiten Sie schnell und Rückgabe der Becher (mit Geschirr) in den Gefrierschrank so schnell wie möglich. Die Fixierung erfolgt komplett in 10-15 min. Danach entfernen Sie die Gerichte aus dem Becher, gieße jede Methanol restlichen in ihnen, und rehydrieren sie durch Zugabe von PBS / 0,1% Triton X-100. Sie sind nun bereit für Standard-Färbeverfahren.
- Formaldehyd ist eine weitere gemeinsame Fixativ. Wir verwenden 10% Formaldehyd in Puffer (PBS ist akzeptabel, aber die Puffer am besten geeignete auf Ihre Bedürfnisse). Wir nutzen diese relativ hohe Konzentration von Formaldehyd, weil S2-ZellenMangel zytoplasmatischen Intermediärfilamente, die sonst helfen würde behaupten, Zellmorphologie und Organisation bei der Fixierung.
- Abgießen Fixativ in einen Abfallbehälter Becherglas und wasche die fixierten Zellen mit drei kurze Wäschen PBST (PBS + 0,1% TritonX-100).
- Als Nächstes fügen Sie 1 ml Blocking-Lösung, um die Zellen für 15 Minuten. Wir verwenden routinemäßig 5% normalem Ziegenserum in PBST.
- Abgießen der Blockierungslösung und fügen primärer Antikörper (verdünnt in Blockierungslösung) direkt auf die Zellen. 100 ul der Antikörper-Lösung sollte vollständig bedecken die Zellen. Setzen Sie den Deckel wieder auf Petri Schale der Verdunstung des Antikörper-Lösung zu verhindern. Lassen Sie den Antikörper inkubieren mit den Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen der Antikörper-Lösung und führen drei PBST gewaschen. Verwenden Sie einen Transfer Pipette 2 ml PBST, die Schüssel hinzu. Warten Sie 5 Minuten zwischen jeder Wäsche (keine Notwendigkeit, schwenken Sie die Schale).
- Abgießen der letzten Waschung und 100 ul des sekundären Antikörper (verdünnt in Blockierungslösung) direkt auf die Zellen. Setzen Sie den Deckel wieder auf Petri Schale der Verdunstung des Antikörper-Lösung zu verhindern. Lassen Sie den Antikörper inkubieren mit den Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper und führen drei 5 Minuten Waschen mit PBST. Nach Abladen der letzten Waschung, mit ein paar Tropfen Ihres Montage Medium der Wahl direkt auf die Zellen. Wir verwenden 0,1 M Propylgallat in eine Lösung von Glycerin gelöst: PBS (9:1) und Lagerung bei 20 ° C. Ersetzen Sie die Petri Deckel und speichern Sie die Schüssel in dunkler Umgebung.
3. Einschränkungen / Problemen
Wie bei allen experimentellen System, gibt es Einschränkungen bei der Verwendung von S2-Zellen. Zunächst kultivierten S2-Zellen weisen typischerweise eine niedrige Mitoseindex (ca. 1% in serum-freien Medien), während die Mitoseindices für viele verwandelt Säugerzelllinien so viel wie 10-fache höher liegen. Daher ist für Untersuchungen der mitotischen Phänotypen, benötigen S2 Zellkulturen eine längere Suche auf entsprechend inszenierte Zellen zu finden. Zweitens, für Zellzyklus-Studien, sind medikamentöse Behandlungen sehr effektiv bei der Festnahme S2-Zellen während bestimmter Phasen des Zellzyklus. Allerdings tun Verbindungen, die reversible Zellzyklus-Arretierung Effekte in kultivierten Säugetierzellen nicht leicht in S2-Zellen Auswaschung. So haben Protokolle für die Synchronisierung von proliferierenden S2-Zellen nicht nachgewiesen. Drittens S2 Zellen sind nicht wandernde noch haben sie Anzeige epithelialen Eigenschaften.
4. Erwartete Ergebnisse
Der größte Pluspunkt für S2-Zellen ist ihr Nutzen als Modellsystem. Sie sind besonders nützlich für die Beurteilung der zellulären Funktionen Ihres Protein von Interesse: S2-Zellen werden durch RNAi mit dsRNA, die leicht ist (und relativ billig) im Labor synthetisiert behandelt, und sie dienen auch für Live-Cell-Analyse und für die Immunfluoreszenz fixierter Zellen . Darüber hinaus ist ein wesentlicher Vorteil für S2-Zellen die Leichtigkeit, mit denen sie im Labor gehalten werden kann, mit relativ preiswerten serum-freiem Medium und kein Gewebekultur-Inkubator.
Ein typisches Experiment würde bedeuten, Beschichtung S2 Zellen in einem geeigneten Gewebekultur-Container (sagen wir, eine 6 oder 96-Well-Platte) und fügte hinzu, hausgemachte dsRNA in die Vertiefungen, und dann die Aufrechterhaltung der Kulturen als der gezielte Proteine allmählich durch RNAi erschöpft sind. Abhängig von der Target-Proteinen zur Neige, können die Zellen eine morphologische und / oder Verhaltensänderungen als Folge der Zielprotein knock-down zu zeigen. Die benötigte Zeit, um Expression des Zielproteins auf ein Minimum zu reduzieren, ist spezifisch für das Protein und sollte durch Western-Blot bestimmt werden.
Normalerweise S2 Zellen nicht strikt einzuhalten Kunststoff oder Glas, und das wäre ein Problem für Experimente erfordern die mikroskopische Untersuchung der behandelten Zellen darstellen. Allerdings kann S2-Zellen induziert, um ausgiebig glätten, indem Sie einfach plating sie auf einer Oberfläche mit dem Lektin Concanavalin A (ConA) beschichtet werden. Innerhalb einer Stunde Plattierung auf ConA, haben die meisten Zellen ihre abgerundete Erscheinung als Folge der Verbreitung ausführlich über die ConA Oberfläche (Abbildung 1) verloren. Die Zellen sind nun bereit für die weitere Verarbeitung (zB durch Fixierung und Immunfärbung) oder mikroskopische Beobachtung lebender Zellen.
S2-Zellen können auch transfiziert (mit einer Vielzahl von chemischen Reagenzien oder Elektroporation) werden, um entweder transient eines exogenen Gens oder stabil zu integrieren das Gen in das Genom (also die Schaffung einer Zelllinie, die exogenen Gens durch wiederholte Teilungen hält). Transfektionen kann vielen Zwecken dienen, wie Ausdruck der fluoreszenzmarkierten Proteine dieser Marke interessierenden Strukturen in festen oder lebende Zellen (Abbildung 2), oder dass als Köder sind in in vivo Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente, etc. verwendet
Die Methode der Analyse hängt von course, auf die biologische Frage, die durch das Experiment gerichtet. Eine gemeinsame Methode zur Analyse des RNAi-behandelten Zellen S2 ist Immunfluoreszenz fixierter Zellen (Abbildung 3). Zum Beispiel ist Immunfluoreszenz in der Regel mit genomweiten Screens von Drosophila-Gen-Bibliotheken verwendet, um schnell zu identifizieren Proteine mit interessanten Aktivitäten in vivo. Die Analyse kann aus aufwendiger, indem Sie gleichzeitig zum Abbau mehrerer Zielproteine in S2-Zellen, um die potentielle funktionelle Wechselwirkungen zwischen der Target-Proteine zu untersuchen. Und kann die Analyse erweitert, um Zellen zu leben, um die Wirkung von RNAi auf dynamische Prozesse zu beobachten. Auch hier sind S2-Zellen speziell für diese Art der Analyse gut geeignet, weil sie auf ConA-beschichtetes Glas-bottom Gerichte vernickelt und visualisiert für viele Stunden auf einem inversen Mikroskop, ohne die Notwendigkeit einer Klimakammer.
Abbildung 1. Phase kontrastreiche Bilder (20-facher Vergrößerung) der S2-Zellen nach dem Ausplattieren auf einer Concanavalin A-beschichteten Glas-bottom Gericht. Die Zahlen geben die Minuten nach dem Beschichten. Beachten Sie, dass die Zellen-Phase dunkel geworden, als sie flach auf den beschichteten Deckgläschen. Zell Abflachung zeigt sich durch 15 min (Pfeile) und ist im Wesentlichen abgeschlossen durch 60 min. Rechts: Vergrößerte Darstellung der anhaftenden Zellen, deren erweitert und abgeflacht Margen sind deutlich sichtbar (Pfeilspitze). Skala bar (für die vier linkes Bild), 20 mm.
Abbildung 2. S2-Zellen transient mit einem Fusionskonstrukt bestehend aus Nucleophosmin (ein Marker für den Kern), fusioniert mit dem Fluorophor, eGFP (grün) transfiziert. Diese Zellen wurden auf einer ConA-beschichteten Glasboden Gericht vernickelt und dann mit DIC und Epifluoreszenz abgebildet. Scale-bar, 15 um.
. Abbildung 3 Feste S2 Zellen immunhistochemisch für PLP (grün, ein Centriol Marker), Mikrotubuli (rot) und Hoechst gefärbt (blau) für die Chromosomen. Vor Fixierung und Immunfärbung wurden die Zellen mit einem 4-tägigen Behandlung mit entweder Kontrolle RNAi oder RNAi Knock-down NCD, ein Kinesin-ähnliches Protein, das Spindel pole "Fokussierung" 4 fördert unterzogen. Beachten Sie die gespreizte Spindelpole und unorganisiert Spindeln in die Zellen mit NCD RNAi behandelt. Scale-bar, 2,5 um.
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Discussion
Für die Zellbiologie Feld wäre ein ideales System kostengünstig in der Wartung, leicht zu manipulieren, und zugänglich für eine Vielzahl von Techniken. Drosophila S2-Zellen erfüllen diese Anforderungen, und so haben sie schnell das System der Wahl für eine wachsende Zahl von Zellen Biologie-Labors.
Wir haben einen kurzen Überblick über die Methoden, die S2-Zellen für die Mikroskopie vorbereitet präsentiert. Eine bemerkenswerte Tugend der S2-Zellen ist die Tatsache, dass sie gut wachsen in normaler Atmosphäre und Raumtemperatur, daher können sie auf das Mikroskop über einen längeren Zeitraum ohne besondere Wartungsaufwand links. Auch wenn sie in der Regel etwas abgerundet und lose anhaftende unter normalen Kulturbedingungen, kann S2-Zellen induziert, um ausgiebig für die Bildgebung abflachen werden. S2-Zellen auf Glas-bottom Gerichte, die vorbeschichtete haben mit Concanavalin A befestigen und zu verbreiten dünn auf das Deckglas, was sie zu ausgezeichneten Mikroskopiepräparate kultiviert.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von der National Cancer Institute P30 CA23074, die American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, und der Univ unterstützt. of Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | serum-free medium |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution |
| Methanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | anhydrous, ACS grade |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
